組織

計画研究

 

研究課題

新生鎖フォールディングとシャペロン効果の網羅解析

研究代表者

田口 英樹(東京工業大学・科学技術創成研究院 細胞制御工学研究センター 教授)
研究室HP

研究概要

 生命現象の根幹をなすタンパク質の機能は立体構造に依拠している。よって、翻訳に伴ってリボソームから新たに生まれてくるポリペプチド鎖(新生鎖)がどのように立体構造を形成(フォールディング)するのかはセントラルドグマ終端における重要課題である。半世紀前のAnfinsenらによる先駆的な実験を端緒としてタンパク質のフォールディングに関して多くの知見が蓄積してきたが、これまでのフォールディング研究は既に完成したタンパク質を変性させた後にフォールディングさせており、リボソームにてN末端から向きをもって合成される新生鎖のフォールディングを反映していない。
 このような背景の下、私たちは大腸菌の再構築型無細胞翻訳系(PUREシステム)を用いて、4000種類を超える大腸菌の全タンパク質を個別に翻訳してフォールディングの性質やシャペロンの影響を解析、シャペロンの細胞内基質を同定するなど、新生鎖のフォールディング研究に新たなアプローチを導入し、世界をリードしている(PNAS, 2009, EMBO J. 2010, PNAS,, 2012)。そこで、本研究では、翻訳に共役したタンパク質フォールディング研究を以下のように拡張することで、セントラルドグマの終端に残された未解決の問題に取り組み、新生鎖フォールディングの全体像、分子機構の解明を目指す。

新生鎖フォールディングの分子機構:
 ・新生鎖フォールディングにおける種々のシャペロンの役割
 ・ヘテロ多量体タンパク質の集合機構の解明
翻訳アレストの普遍性・分子機構の解明
真核生物PUREシステムを用いたフォールディング、シャペロンの作用機構研究

代表的な論文

1. Chadani, Y., Niwa, T., Izumi, T., Sugata, N., Nagao, A., Suzuki, T.,Chiba, S., Ito, K. and Taguchi, H.
Intrinsic Ribosome Destabilization Underlies Translation and Provides an Organism with a Strategy of Environmental Sensing.
Mol Cell. 68, 528-539.e5. (2017) doi: 10.1016/j.molcel.2017.10.020.
2.

Yuhei Chadani, Tatsuya Niwa, Shinobu Chiba, Hideki Taguchi, Koreaki Ito
Integrated in vivo and in vitro nascent chain profiling reveals widespread translational pausing
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113 (2016)  doi:10.1073/pnas.1520560113
http://www.pnas.org/content/early/2016/01/27/1520560113.abstract

広報記事
タンパク質合成過程における「緩急のリズム」を実証 -大腸菌遺伝子産物中間状態を網羅的に解析-
http://www.kyoto-su.ac.jp/news/20160205_345_release_ka02.html
http://www.titech.ac.jp/news/2016/033388.html

3. Niwa, T., Sasaki, Y., Uemura, E., Nakamura, S., Akiyama, M., Ando, M., Sawada, S., Mukai, SA., Ueda, T., Taguchi, H., Akiyoshi, K.
Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system.
Sci Rep. 2015 Dec 15;5:18025. doi: 10.1038/srep18025.
4. T, Niwa., K, Fujiwara., Taguchi, H.
Identification of novel in vivo obligate GroEL/ES substrates based on data from a cell-free proteomics approach.
FEBS Lett., in press
5. Okuda M, Niwa T., * Taguchi, H.
Single-molecule analyses on the dynamics of heat shock protein 104 (Hsp104) and protein aggregates.
J. Biol. Chem. 290 in press (2015)
6.

Ishimoto, T., Fujiwara, K., Niwa, T., * Taguchi, H.
Conversion of a chaperonin GroEL-independent protein into an obligate substrate.

J. Biol. Chem. 289, 32073-32080 (2014)
7.

Koike-Takeshita, A., Mitsuoka, K., *Taguchi, H.
Asp52 in combination with Asp398 plays a critical role in ATP hydrolysis of chaperonin GroEL.
J. Biol. Chem. 289, 30005-30011 (2014)

8.

Koike-Takeshita, A., Arakawa T., *Taguchi, H., *Shimamura, T.
Crystal structure of a symmetric football-shaped GroEL:GroES2 complex determined at 3.8Å reveals rearrangement between two GroEL rings.

J. Mol. Biol., 426, 3634-3641 (2014)
9.

Niwa, T., Kanamori, T., *Ueda, T., and *Taguchi, H.
Global Analysis of Chaperone Effects Using a Reconstituted Cell-Free Translation System.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 8937-8942 (2012)
10.

*Takemoto K, Niwa T, Taguchi, H.
Difference in the distribution pattern of substrate enzymes in the metabolic network of Escherichia coli, according to chaperonin requirement.
BMC Syst Biol. 5, 98 (2011)

11.

Kawai-Noma, S., Pack, C.-G., Kojidani, T., Asakawa, H., Hiraoka, Y., Kinjo, M., Haraguchi, T., *Taguchi, H., and Hirata, A.
In vivo evidence for the fibrillar structures of Sup35 prions in yeast cells.

J. Cell Biol. 190, 223-231 (2010)
12.

Fujiwara, K., Ishihama, Y., Nakahigashi, K., Soga, T., and *Taguchi, H.
A systematic survey of in vivo obligate chaperonin-dependent substrates.

EMBO J. 29, 1552-1564 (2010)
13.

Niwa, T., Ying, B.-W., Saito, K., Jin, W. Z., Takada, S., *Ueda, T., and *Taguchi, H.
Bimodal protein solubility distribution revealed by an aggregation analysis of the entire ensemble of Escherichia coli proteins.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 4201-4206 (2009)
14.

Koike-Takeshita, A., Yoshida, M., and *Taguchi, H.
Revisiting the GroEL-GroES reaction cycle via the symmetrical intermediate implied by novel aspects of the GroEL (D398A) mutant.

J. Biol. Chem. 283, 23774-23781 (2008)
15.

Ying, B.-W., *Taguchi, H., *Ueda, T.
Co-translational binding of GroEL to nascent polypeptides is followed by post-translational encapsulation by GroES to mediate protein folding.

J. Biol. Chem. 281, 21813-21819 (2006)
16.

Ying, B.-W., Taguchi, H., Kondo, M., *Ueda, T.
Co-translational involvement of the chaperonin GroEL in the folding of newly translated polypeptides.

J. Biol. Chem. 280, 12035-12040 (2005)
17.

Ueno, T.#, Taguchi, H.#, Tadakuma, H., *Yoshida, M., and *Funatsu, T. [# equally contributed]
GroEL mediates protein folding with a two successive timer mechanism.
Mol. Cell 14, 423-434 (2004)

【総説】

*Taguchi, H., and Kawai-Noma, S.
Diffuse oligomer-based transmission of yeast prions. (review).

FEBS J. 277, 1359-1368 (2010)

*Taguchi, H.
Chaperonin GroEL Meets the Substrate Protein as a "Load" of the Rings (review)
J. Biochem. 137, 543-549 (2005)

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研究課題

ヒト因子由来再構成型翻訳システムの構築とその応用

分担研究者

今高 寛晃(兵庫県立大学・大学院工学研究科 教授)
研究室HP

研究概要

 真核細胞、特にヒトの翻訳機構の解明を再構成型翻訳システム(図)の技術開発を行いながら進めています。我々はヒト細胞抽出液由来の試験管内タンパク質合成システムを開発してきました(論文2,4,6,7,8,10,11,12)。このシステムは本質的には細胞内と変わりなく無数の無関係な因子を含んでいるため、これでは翻訳メカニズムの解明に到達することはできません。限られた因子で再構成され、in vivoの翻訳現象を試験管内で再現するシステムは、原核細胞ではすでにPUREsystemとして開発されていますが、真核細胞の再構成型翻訳システムは長らくその開発が待たれていました。そこで、我々は真核細胞(ヒト)の翻訳機構(新生鎖の意義)の研究を遂行するために、まず、翻訳開始因子を必要としない再構成系を開発しました(論文1)。この系を用いて、脳心筋炎ウイルスの2A-2Bの分断は翻訳伸長の最中に起こり、翻訳終結因子を必要としないことがわかりました(論文1)。このように、当システムは「新生鎖の生物学」の研究ツールとして信頼性を持って使用できます。
 目下のところ、このシステムにシャペロニンCTT(論文5)を始めとするシャペロン分子を添加し、ヒト新生鎖のフォールデイング機構を研究できるシステムに発展させようとしています。また、翻訳開始因子(論文3,9)を含めた完全再構成翻訳システムを構築しようとしています。更には、これらのシステムをリポソームに包含し、よりin vivoに近づけたシステムに進化させていきます。

期間内に以下の項目を行う予定です。
(1) 脳心筋炎ウイルス2A新生鎖による翻訳終結・再開始機構の更なる解析
(2) 新生鎖フォールデイングにおけるシャペロニンCTT各サブユニットの役割の解明
(3) 翻訳開始因子を含めた完全再構成型翻訳システム(ヒト型)の完成
(4) リポソームに包含された完全再構成型翻訳システム(ヒト型)の開発

代表的な論文

1. Machida K, Kanzawa K, Shigeta T, Yamamoto Y, Tsumoto K, and *Imataka H
Huntingtin polyglutamine-dependent protein aggregation in reconstituted cells.
ACS synthetic Biology 7: 377-383 (2018) doi: 10.1021/acssynbio.7b00372
2. Uemura E, Niwa T, Minami S, Takemoto K, Fukuchi S, Machida K, Imataka H, Ueda T, Ota M, and Taguchi H
Large-scale aggregation analysis of eukaryotic proteins reveals an involvement of intrinsically disordered regions in protein folding.
Scientific Reports 8: 678 (2018) doi: 10.1038/s41598-017-18977-5
3. Daiko Y, Mizutani S, Machida K. Imataka H, Honda S and Iwamoto Y
H+ emission under room temperature and non-vacuumatmosphere from a sol–gel-derived nanoporous emitter
J Sol-Gel Sci. Technol. 83: 252-258 (2017) doi:10.1007/s10971-017-4430-z
4. Machida K, Shigeta T, Kobayashi A, Masumoto A, Hidaka Y and *Imataka H
Cell-free analysis of polyQ-dependent protein aggregation and its inhibition by chaperone proteins
J. Biotechnology 239:1-8 (2016) doi: 10.1016/j.jbiotec.2016.09.031
5. Kashiwagi K, Shigeta T, Imataka H, Ito T, and Yokoyama S
Expression, purification, and crystallization of Schizosaccharomyces pombe eIF2B
J. Structural and Functional Genomics 17: 33-38 (2016) doi:10.1007/s10969-016-9203-3
6. Ozdemir A, Machida K, Imataka H, and Catling A
Identification of the T-complex protein as a binding partner for newly synthesized Cytoplasmic Dynein Intermediate
Biochem. Biophys. Res. Commun. 469: 126-131 (2016) doi: 10.1016/j.bbrc.2015.11.082
7. Machida K and *Imataka H
Production methods of virus particles.
Biotechnology Letters 37: 753-760 (2015) doi: 10.1007/s10529-014-1741-9
8.

Machida K, Mikami S, Masutani M, Mishima K, Kobayashi T, and *Imataka H
A translation system reconstituted with human factors proves that processing of encephalomyocarditisvirus proteins 2A and 2B occurs in the elongation phase of translation without eukaryotic release factors
J. Biol. Chem. 289: 31960-31971 (2014) doi: 10.1074/jbc.M114.593343

9. Fukao A, Mishima Y, Takizawa N, Oka S, Imataka H, Pelletier J, Sonenberg N, Thoma C, and Fujiwara T
MicroRNAs Trigger Dissociation of eIF4AI and eIF4AII from Target mRNAs in Humans
Mol.Cell 56: 79-89 (2014) doi: 10.1016/j.molcel.2014.09.005
10. Kobayashi T, Machida K, and *Imataka H
Human cell extract-derived cell-free systems for virus synthesis. In: Alexandrov,K. and Johnston,W.A. (Eds.), Methods in Molecular Biology 1118, Cell-free protein synthesis: Methods and Protocols. Humana Press, pp149-156 (2014) doi: 10.1007/978-1-62703-782-2_9
11.

Kobayashi, T., Yukigai, J., Ueda, K., Machida, K., Masutani, M., Nishino, Y., Miyazawa, A., *Imataka, H.
Purification and visualization of encephalomyocarditisvirus synthesized by an in vitro protein expression system derived from mammalian cell extract.

Biotechnology Letters 35, 309-314 (2013)
12.

Masutani, M., Machida, K., Kobayashi, T., Yokoyama, S., *Imataka, H.
Reconstitution of eukaryotic translation initiation factor 3 by co-expression of the subunits in a human cell-derived in vitro protein synthesis system.

Protein Expression and Purification 87, 5-10 (2013)
13.

Kobayashi, T., Nakamura, Y., Mikami, S., Masutani, M., Machida, K. *Imataka, H.
Synthesis of encephalomyocarditis virus in a cell-free system: from DNA to RNA virus in one tube.
Biotechnology Letters 34, 67-73 (2012)

14.

Machida, K., Masutani, M., Kobayashi, T., Mikami, S., Nishino, Y., Miyazawa, A., *Imataka, H.
Reconstitution of the human chaperonin CCT by co-expression of the eight distinct subunits in mammalian cells.

Protein Expression and Purification 82, 61-69 (2012)
15.

Kobayashi, T., Machida, K., Mikami, S., Masutani, M., *Imataka, H.
Cell-free RNA replication systems based on a human cell extracts-derived in vitro translation system with the encephalomyocarditisvirus RNA.

J. Biochem. 150, 423-430 (2011)
16.

Mikami, S., Kobayashi, T., Machida, K., Masutani, M., Yokoyama, S., *Imataka, H
N-terminally truncated GADD34 proteins are convenient translation enhancers in a human cell-derived in vitro protein synthesis system.
Biotechnology letters 32, 897-902 (2010)

17.

Mikami, S., Kobayashi, T., Masutani, M., Yokoyama, S., *Imataka, H.
A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins.

Protein Expression and Purification 62, 190-198 (2008)
18.

Masutani, M., Sonenberg, N., Yokoyama, S., *Imataka, H.
Reconstitution reveals the functional core of mammalian eIF3.

EMBO J. 26, 3373-3383 (2007)
19.

Kobayashi, T., Mikami, S., Yokoyama, S., *Imataka, H.
An improved cell-free system for picornavirus synthesis.

J. Virol. Methods 142, 182-188 (2007)
20.

Mikami, S., Kobayashi, T., Shigeyuki Yokoyama, *Imataka, H.

A hybridoma-based in vitro translation system that efficiently synthesizes glycoproteins. J.Biotechnol. 127, 65-78 (2006)
21.

Mikami, S., Masutani, M., Sonenberg, N., Shigeyuki Yokoyama, *Imataka, H.
An efficient mammalian cell-free translation system supplemented with translation factors.

Protein Expression and Purification 46, 348-357 (2006)
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研究課題

酵母由来再構成型翻訳システムの開発:翻訳伸長制御のメカニズムとその意義

分担研究者

富田(竹内) 野乃(東京大学大学院新領域創成科学研究科 准教授)
研究室HP

研究概要

 翻訳速度の制御は遺伝子発現の様々な局面で積極的に利用されており、翻訳伸長中のリボソームは、翻訳伸長制御因子(図、オレンジ)やリボソーム結合シャペロン(図、ピンク。Ssb, RAC, NACなど)などの様々な因子の作用により翻訳速度/ペプチド転移反応の制御を受ける。本研究では、翻訳伸長制御因子やリボソーム結合シャペロンがペプチド転移反応を制御する分子メカニズムを明らかとするとともに、酵母由来再構築型生体外蛋白質合成系に翻訳伸長制御因子やリボソーム結合シャペロンを導入することにより、翻訳伸長速度を調節できるシステムへ発展させる。さらにこのシステムを応用することにより、蛋白質輸送機構やRNA・新生鎖品質管理機構などの翻訳と共役した遺伝子発現制御機構を解明することを目指す。具体的には以下の課題に取り組む。

(1) 酵母由来再構築型翻訳システムの確立および改良
(2) Non-canonicalな翻訳伸長因子の機能解析
• Stm1: 翻訳抑制の分子機序とリボファジーにおける役割の解明
• eEF3: 翻訳伸長過程における役割の解明(配列特異性の解析)
• eIF5A: 翻訳伸長過程における役割の解明(配列特異性の解析)
(3) 新生ペプチド鎖と相互作用するシャぺロンの機能解析
• Ssb・RAC : 連続した塩基性アミノ酸配列におけるPremature Terminationの制御機構の解析
• NAC:膜蛋白質のSignal Anchor配列やTail Anchor配列の翻訳における役割の解明

代表的な論文(*: corresponding author)

1.

Akabane, S., Ueda, T., Knud H. Nierhaus, KH. & *Takeuchi N.
Ribosome rescue and translation termination at non-standard stop codons by ICT1 in mammalian mitochondria.

PLoS Genet. 8.10(9), e1004616 (2014)
2.

Kotani, T., Akabane, S., Takeyasu, K., Ueda, T. and *Takeuchi, N.
Human G-proteins, ObgH1 and Mtg1, associate with the large mitochondrial ribosome subunit and are involved in translation and assembly of respiratory complexes.

Nucleic Acids Res. 41, 3713-22 (2013)
3.

Kurata, S., Shen, B., Liu, JO., Takeuchi, N., Kaji, A. and Kaji, H.
Possible steps of complete disassembly of post-termination complex by yeast eEF3 deduced from inhibition by translocation inhibitors.

Nucleic Acids Res. 41, 264-76 (2013)
4.

Akama, K., Christian, BE., Jones, CN., *Takeuchi, N., and Spremulli, LL.
Analysis of the Functional Consequences of Lethal Mutations in Mitochondrial Translational Elongation Factors.

Biochimica et Biophysica Acta 1802, 692-698 (2010)
5.

Suematsu, T., Yokobori, SI., Morita, H., Yoshinari, S., Ueda, T., Kita, K., *Takeuchi, N., Watanabe, YI.
A bacterial elongation factor G homolog exclusively functions in ribosome recycling in the spirochaete Borrelia burgdorferi.

Mol Microbiol. 75, 1445-1454 (2010)
6.

Tsuboi, M., Morita, H., Nozaki, Y., Akama, K., Ueda, T., Ito, K., Nierhaus, KH., and *Takeuchi, N.
EF-G2mt is an Exclusive Recycling Factor in Mammalian Mitochondrial Protein Synthesis.

Molecular Cell 35(4), 502-10 (2009)
7.

Ishizawa, T., Nozaki, Y., Ueda T., *Takeuchi ,N.
The human mitochondrial translation release factor HMRF1L is methylated in the GGQ motif by the methyltransferase HMPrmC.

Biochem Biophys Res Commun. 373, 99-103 (2008)
8.

Nozaki, Y., Matsunaga, N., Ishizawa, T., Ueda, T., *Takeuchi, N.
HMRF1L is a human mitochondrial translation release factor involved in the decoding of the termination codons UAA and UAG.

Genes Cells. 13, 429-38 (2008)
9.

Hayashi, R., Ueda, T., Farwell, MA., *Takeuchi, N.
Nuclear respiratory factor 2 activates transcription of human mitochondrial translation initiation factor 2 gene.

Mitochondrion. 7, 195-203 (2007)
10.

Suzuki, H., Ueda, T., Taguchi, H., *Takeuchi, N.
Chaperone properties of mammalian mitochondrial translation elongation factor Tu.

J Biol Chem. 282, 4076-84 (2007)
【総説】
1.

富田(竹内)野乃、上田卓也
「翻訳伸長制御のメカニズムとその意義」

実験医学増刊号『生命分子を統合するRNA』31, 1108-1116 羊土社 (2013)
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研究課題

mRNAとタンパク質の品質管理機構における新生鎖の新規機能の解明

研究代表者

稲田 利文(東北大学・大学院薬学研究科 教授)
研究室HP

研究概要

 正確な遺伝子発現は生命現象の根幹であり、その破綻や異常は様々な疾患の原因となる。我々は、異常なmRNA由来の新生鎖の分解機構やmRNA切断における新生鎖の機能を明らかにした。リボソームが連続した塩基性配列を持った新生鎖を合成すると、翻訳伸長段階で停止(翻訳アレスト)する(図①)。その結果、No-Go-Decay(NGD)と呼ばれるmRNA品質管理機構によってmRNAが切断される(図②)。さらに、リボソームが各サブユニットに解離し、60Sサブユニット上の新生鎖がユビキチン化された後にプロテアソームによって迅速に分解される(図③)。最近申請者は、この異常新生鎖による翻訳アレストの結果としてmRNAとタンパク質の品質管理機構が作動するためには、E3ユビキチンライゲースHel2による停滞したリボソーム上の標的因子のユビキチン化が必須であることを見出した(図①)。
本計画研究研究では、遺伝子発現の正確性を保証するmRNAとタンパク質の品質管理機構における、新生鎖の新規機能新生鎖の運命決定機構の解明をめざし、以下の項目を解析する。

(1) 特異的配列を持つ新生鎖による翻訳アレストの分子機構
(2) 翻訳アレストによる新生鎖分解とmRNA切断におけるE3ユビキチンライゲースHel2の機能解析Hel2が翻訳アレスト状態のリボソームを認識し、標的因子をユビキチン化することで、mRNA品質管理機構へと導く分子機構の理解を目指す。
(3) フォールディングか分解かの新生鎖の運命決定機構とmRNA品質管理因子の機能

代表的な論文

1. Matsuo, Y., Ikeuchi, K., Saeki, Y., Iwasaki, S., Schmidt, C., Udagawa, T., Sato, F., Tsuchiya, H., Becker, T., Tanaka, K., Ingolia, NT., Beckmann, R. and *Inada, T.
Ubiquitination of Stalled Ribosome Triggers Ribosome-associated Quality Control.
Nat. Commun. DOI 10.1038/s41467-017-00188-1 (2017)
2.
  • Sugiyama T, Nobuta R, Ando K, Matsuki Y,  *Inada, T.
    Crucial role of ATP-bound Sse1 in Upf1-dependent degradation of the truncated product. Biochem Biophys Res Commun. 488, 122-128. doi: 10.1016/j.bbrc.2017.05.0 (2017)

3. Ikeuchi, K., Yazaki, E., Kudo, K. and *Inada, T.
Conserved functions of human Pelota in mRNA quality controls for nonstop mRNA.
FEBS Let. 18, 3254-3263 (2016)
4. Ikeuchi, K. and *Inada, T.
Ribosome-associated Asc1/RACK1 is required for endonucleolytic cleavage induced by stalled ribosome at the 3' end of nonstop mRNA.
Sci. Rep. 6, 28234. (2016)
5.
  • Makino, S., Mishima, Y., Inoue, K. and *Inada, T. 
    Roles of mRNA-fate modulators Dhh1 and Pat1 in TNRC6-dependent gene silencing recapitulated in yeast. 
    J Biol. Chem. (2015)

6.
  1. Tanaka, Y., Tsuda, S., Kunikata, H., Sato, J., Kokubun, T., Yasuda, M., Nishiguchi, KM., Inada, T., *Nakazawa, T.
    Profiles of extracellular miRNAs in the aqueous humor of glaucoma patients assessed with a microarray system.

    Sci Rep. 4, 5089 (2014)
7.

Matsuda, R., Ikecuhi, K., Nomura, S. and *Inada, T.
Protein quality control systems associated with No-Go and Nonstop mRNA surveillance in yeast.

Genes Cells 19, 1-12 (2014)
8.

Kuroha, K., Ando, K., Nakagawa, R., *Inada, T.
The Upf complex interacts with aberrant products derived from mRNAs containing a premature termination codon and facilitates their proteasomal degradation.

J Biol. Chem. 288, 28630-28640 (2013)
9.

Galipon, J., Miki, A., Oda, A., Inada, T., *Ohta, K.
Stress-induced lncRNAs evade nuclear degradation and enter the translational machinery.

Genes Cells 18, 353-368 (2013)
10.

Iwasaki, YW., Kiga, K., Kayo, H., Fukuda-Yuzawa, Y., Weise, J., Inada, T., Tomita, M., Ishihama, Y., *Fukao, T.
Global microRNA elevation by inducible Exportin 5 regulates cell cycle entry.

RNA 19, 490-497 (2013)
11.

Tsuboi, T., Kuroha, K., Kudo, K., Makino S., Inoue, E., Kashima, I. and Inada, T.
Dom34:Hbs1 Plays a General Role in Quality Control Systems by Dissociation of Stalled Ribosome at 3’ End of Aberrant mRNA.

Mol. Cell 26, 518-529. (2012)
12.

Brandman, O., Ornstein, JS., Wong, D., Larson, A., Williams, C.C, Li, G.W., Zhou, S., King, D., Shen, P.S, Weibezahn, J., Dunn, J.G, Rouskin, S., Inada, T., Frost, A., Weissman, JS.
A ribosome-bound quality control complex triggers nascent peptides and signals translation stress.

Cell 151, 1042-1054. (2012)
13.

Izawa, T., Tsuboi, T., Kuroha, K., Inada, T., Nishikawa, SI., Endo, T.
Roles of Dom34:Hbs1 in Nonstop Protein Clearance from Translocators for Normal Organelle Protein Influx.

Cell Rep. 2, 447-453. (2012)
14.

Kuroha, K., Akamatsu, M., Dimitrova, L., Ito, T., Kato, Y. Shirahige, K. and Inada, T.
RACK1 stimulates nascent polypeptide-dependent translation arrest.

EMBO Rep. 11, 956-961. (2010)
15.

Kobayashi, K. Kikuno, I. Kuroha, K. Saito, K. Ito, K. Ishitani, R. Inada, T. and Nureki, O.
Structural Basis for mRNA Surveillance by Archaeal Pelota and GTP-bound EF1α Complex.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 17575-17579. (2010)
16.

Kuroha, K., Tatematsu, T. and Inada, T.
Upf1p stimulates proteasome-mediated degradation of the product derived from the specific nonsense-containing mRNA.

EMBO Rep. 10, 1265-1271. (2009)
17.

Kuroha, K., Dimitrova, L., Tatematsu, T. and Inada, T.
Nascent peptide-dependent translation arrest leads to not4p-mediated protein degradation by the proteasome.

J. Biol. Chem. 284, 10343-10352. (2009)
18.

Ito-Harashima, S., Kuroha, K., Tatematsu, T. and Inada, T.
Translation of poly(A) tail plays crucial roles in nonstop mRNA surveillance via translation repression and protein destabilization by proteasome in yeast.

Genes Dev. 21, 519-524. (2007)
19.

Inada, T. and Aiba, H.
Translation of aberrant mRNAs lacking a termination codon or with a shortened 3'-UTR is repressed after initiation in yeast.

EMBO J. 24, 1584-1595. (2005)
【総説】
1.

*Inada, T.
The ribosome as a platform for mRNA and nascent polypeptide quality control.

Trends Biochem. Sci. 42, 5-15 (2017)
2.

Inada, T., Makino S.
Novel roles of the multi-functional CCR4-NOT complex in post-transcriptional regulation. (review).

Front Genet. 20; 5-135. (2014)
3.

Inada, T.
Ribosome as a hub for protein and mRNA quality control and gene regulation. (review).

Seikagaku. 85(10):932-7. (2013)
4.

Inada, T.
Quality control systems for aberrant mRNAs induced by aberrant translation elongation and termination.
Biochim Biophys Acta. 1829, 634-642. (2013)

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研究課題

タンパク質の品質管理の基質となる新生鎖の解明

分担研究者

長尾 翌手可(東京大学・工学系研究科・助教)
研究室HP

研究概要

 バクテリア翻訳系では、翻訳伸長初期段階において、合成中の新生ペプチド鎖がtRNAに結合した状態でリボソームから脱離する現象(drop-off)が恒常的に起きている。我々はこれまで、質量分析法とRNA単離法を駆使し、細胞内でdrop offした新生ペプチジルtRNA(pep-tRNA)を定性的・定量的に解析することに成功している。それらのペプチド部分の配列解析の結果、その多くはORFの開始近傍の配列に帰属できたが、大腸菌ORFの配列と一致しないペプチド鎖を有するpep-tRNA(non-cognate pep-tRNA)が検出された。詳細な解析から、これらのpep-tRNAはnon-cognateなアミノアシルtRNAがAサイトに入り、ペプチド転移反応によってPサイトtRNAのペプチド鎖を引き受けた後にdrop offしたものであることが判明した。また、non-cognate pep-tRNAは翻訳の次のステップに持ち越されないことから、誤って生成されたpep-tRNAはdrop offによって積極的に翻訳系から排除されるといった、ペプチド転移反応以後における新しい翻訳校正機構が示唆された。本研究では、翻訳初期におけるpep-tRNA drop-offが翻訳精度・効率に与える影響を検証し、新しい遺伝子発現調節機構の提唱を目指す。また、drop-offに関わる翻訳因子やrRNA・tRNA分子の構造的要素を特定し、その機能を明らかにするとともに、新生ペプチド鎖の監視機構として果たす役割についても追究していきたい。drop offが通常の翻訳において恒常的に起きているということは、翻訳を開始してはやり直すといったabortive translationの存在を示唆しており、最終的にはこのabortive translationが翻訳効率や遺伝子構成、特に出だしのコドン配列の制約の進化にどのような影響を及ぼしているのかについて追究し、新生ペプチド鎖と遺伝子発現調節機構を結び付けるような全く新しい概念を樹立したいと考えている。

代表的な論文

1. Chadani, Y., Niwa, T., Izumi, T., Sugata, N., Nagao, A., Suzuki, T.,Chiba, S., Ito, K. and Taguchi, H.
Intrinsic Ribosome Destabilization Underlies Translation and Provides an Organism with a Strategy of Environmental Sensing.
Mol Cell. 68, 528-539.e5. (2017) doi: 10.1016/j.molcel.2017.10.020.
2.

Chujo, T., Ohira, T., Sakaguchi, Y., Goshima, N., Nomura, N., Nagao, A. and Suzuki, T.
LRPPRC/SLIRP suppresses PNPase-mediated mRNA decay and promotes polyadenylation in human mitochondria

Nucleic Acids Res. 40, 8033-8047 (2012)
3.

Suzuki, T., Nagao, A. and Suzuki, T.

Human mitochondrial tRNAs: biogenesis, function, structural aspects and diseases Annu Rev Genet. 45, 299-329 (2011)
4.

Suzuki, T., Nagao, A. and Suzuki, T.
Human mitochondrial diseases caused by lack of taurine-modification in mitochondrial tRNAs

WIREs. RNA 2, 376-386 (2011)
5.

Kato, M., Araiso, Y., Noma, A., Nagao, A., Suzuki, T., Ishitani, R. and Nureki, O.
Crystal structure of a novel jmjC-domain-containing protein, TYW5, involved in tRNA modification.

Nucleic Acids Res. 39, 1576-1585 (2011)
6.

Noma, A., Ishitani, R., Kato, M., Nagao, A., Nureki, O. and Suzuki, T.
Expanding role of the Jumonji C domain as an RNA hydroxylase.

J. Biol. Chem. 285, 34503-34507 (2010)
7.

Nagao, A., Suzuki, T., Katoh, T., Sakaguchi, Y. and Suzuki, T.
Biogenesis of glutaminyl-mt tRNAGln in human mitochondria.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 16209-16214 (2009)
8.

Nagao, A., Shigi-Hino, N. and Suzuki, T.
Measuring mRNA decay in human mitochondria.

Methods Enzymol. 447, 489-499 (2008)
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研究課題

RISCによる遺伝子発現制御とRNAとタンパク質の品質管理機構

分担研究者

岩川 弘宙(東京大学・定量生命科学研究所・助教)
研究室HP

研究概要

 microRNAを代表とする小分子RNAはArgonaute (AGO)タンパク質とRNA induced silencing complex(RISC)を形成し、相補的な配列をもつmRNAの遺伝子発現を負に制御する。植物RISCは標的を切断すると共に翻訳を抑制することが知られている。我々は植物由来のセルフリー系を用いることにより、タンパク質コード領域に結合したRISCが、標的を切断するだけでなく(図①)、リボソームの進行を物理的に阻害し、翻訳アレストを引き起こすことを見出した(図②)。
 本研究では、RISCによる翻訳アレスト機構の解明を目指すとともに、RISCによる遺伝子発現制御とRNAとタンパク質の品質管理機構との関係性を明らかにすることを目標とする。すなわち、RISCによる切断および翻訳伸長阻害を受けたmRNA、そして、それら標的mRNA上で正常に翻訳終結されない新生ポリペプチド鎖(図①②)が、細胞の品質管理機構によって認識され分解されるのかを調べ、その分子機構を解析する。

代表的な論文

1. Baeg K, Tomari Y, *Iwakawa HO
In vitro RNA-dependent RNA Polymerase Assay Using Arabidopsis RDR6
Bio-protocol 8(1), (2018)
2. *Iwakawa HO, *Tomari Y
Silencing messages in a unique way
Nature Plants 3(10), 769-770.(2017)
3. Watanabe M, Iwakawa HO, Tadakuma H, Tomari Y
Biochemical and single-molecule analyses of the RNA silencing suppressing activity of CrPV-1A
Nucleic acids research 45(18), 10873-10844.(2017)
4. Tajima Y, Iwakawa HO, Hyodo K, Kaido M, Mise K, Okuno T
Requirement for eukaryotic translation initiation factors in cap-independent translation differs between bipartite genomic RNAs of red clover necrotic mosaic virus
Virology 509,152-158. (2017)
5.

Tomari Y, *Iwakawa HO
In Vitro Analysis of ARGONAUTE-Mediated Target Cleavage and Translational Repression in Plants
Methods in Molecular Biology 1640, 55-71. (2017)

6.
  1. Kyungmin Baeg, Hiro-oki Iwakawa*, Yukihide Tomari* (*corresponding authors)
    The poly(A) tail blocks RDR6 from converting self mRNAs into substrates for gene silencing
    Nature Plants, 20 March 2017 | Volume: 3 | Article number: 17036, doi:10.1038/nplants.2017.36
    またこの論文はNature Plants 4月号の表紙を飾りました。
    広報記事
    1. プレスリリース
    http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/pressrelease/170321/
    2. EurekAlert!
    https://www.eurekalert.org/pub_releases/2017-03/uot-hpc031717.php
    3. UTokyo research
    http://www.u-tokyo.ac.jp/ja/utokyo-research/research-news/how-plants-can-tell-friend-from-foe.html
    報道
    日経産業新聞 2017年4月7日 8ベージ
7.

Fukaya, T.#, Iwakawa, HO.#, Tomari ,Y.
MicroRNAs Block Assembly of eIF4F Translation Initiation Complex in Drosophila.

Mol Cell. 56(1), 67-78 (2014)
8.

Iwakawa, HO., Tomari, Y.
Molecular insights into microRNA-mediated translational repression in plants.

Mol. Cell. 52(4), 591-601 (2013)
9.

Endo, Y., *Iwakawa, HO., *Tomari, Y.
Arabidopsis ARGONAUTE7 selects miR390 through multiple checkpoints during RISC assembly.

EMBO Rep. 14(7), 652-8 (2013)
10.

Iwakawa, HO., Tajima, Y., Taniguchi, T., Kaido, M., Mise, K., Tomari, Y., Taniguchi, H., Okuno, T.
Poly(A)-binding protein facilitates translation of an uncapped/nonpolyadenylated viral RNA by binding to the 3' untranslated region.

J. Virol. 86(15), 7836-49 (2012)
11.

Iwakawa, HO., Mizumoto, H., Nagano, H., Imoto, Y., Takigawa, K., Sarawaneeyaruk, S., Kaido, M., Mise, K., Okuno, T.
A Viral Noncoding RNA Generated by cis-Element-Mediated Protection against 5'->3' RNA Decay Represses both Cap-Independent and Cap-Dependent Translation
J. Virol. 82(20), 10162-74 (2008)

【総説】
1.

Hiro-oki Iwakawa, Yukihide Tomari
【Review】The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression

Trends in Cell Biology  25(11), 651-665(2015)
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研究課題

新生鎖研究のための新規な翻訳解析技術の開発とその応用

研究代表者

田中 元雅(国立研究開発法人理化学研究所 脳神経科学研究センター チームリーダー)
研究室HP

研究概要

 mRNAの翻訳は生命活動の中心的な役割を果たす。翻訳の際に使われるtRNAにはコードするアミノ酸が同じ縮重したものが存在している。その生理的意義には不明な点が多いが、翻訳時にリボソームによってどのtRNAが選択されるかで翻訳速度が調節され、それによって、新生鎖のフォールディング構造などの様々な新生鎖の構造、機能に変化をもたらし、ひいては高次機能にも影響を与えることが最近見出されてきた。本研究では、翻訳におけるtRNA選択の生理的意義の解明を目指し、出芽酵母を用いて、in vivoで翻訳に使われているtRNAとmRNAを網羅的かつ定量的に明らかにするためのリボソームプロファイリングの技術開発を行う。
また、神経細胞のスパインにおける局所翻訳の異常は様々な精神・神経変性疾患に関わる。そこで、スパインにおける局所翻訳の実態解明を目指し、新たな翻訳解析技術の開発を行うとともに、局所翻訳異常や新生鎖のBiogenesisが精神・神経変性疾患にどのように関わるか明らかにする。
以上から、本計画研究では、新生鎖研究のための新規な翻訳解析技術の開発および以下の新生鎖が関わる生命現象の解明を目指す。

(1) 酵母や神経細胞における新生鎖研究のための新たな翻訳解析技術の開発
(2) 翻訳一時停止と環境ストレス下での翻訳制御の分子機構解明
(3) スパインにおける局所翻訳異常に着目した精神・神経変性疾患の病態解明

代表的な論文

1. Chen, C. W. and Tanaka, M.
Genome-wide Translation Profiling by Ribosome-Bound tRNA Capture.
Cell Rep. 23, 608-621, (2018). doi: 10.1016/j.celrep.2018.03.035.
プレスリリース: http://www.riken.jp/pr/press/2018/20180411_1/
2. Suzuki, G., Weissman, J.S., Tanaka, M.
[KIL-d] Protein Element Confers Antiviral Activity via Catastrophic Viral Mutagenesis
Molecular Cell, 60, 651-660 (2015), doi: 10.1016/j.molcel.2015.10.020
プレスリリース(日本語の解説):http://www.riken.jp/pr/press/2015/20151120_1/
3.

Nilsson, P., Loganathan, K., Sekiguchi, M., Matsuba, Y., Hui, K., Tsubuki, S., Tanaka, M., Iwata, N., Saito, T., and Saido, T.C.
Aβ secretion and plaque formation depend on autophagy.

Cell Reports 5, 61-69 (2013).
4.

Suzuki, G. Shimazu, N., and *Tanaka, M.
A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.

Science 336, 335-339 (2012).
5.

Foo, C.K., Ohhashi, Y., Kelly, M.J., Tanaka, M., Weissman, J.S.
Radically Different Amyloid Conformations Dictate the Seeding Specificity of a Chimeric Sup35 Prion.

J. Mol. Biol. 408, 1-8 (2011).
6.

Ohhashi, Y., Ito, K., Toyama, B.H., Weissman, J.S., and *Tanaka, M.
Differences in prion strain conformations result from non-native interactions in a nucleus.

Nat. Chem. Biol. 6, 225-230 (2010).
7.

Nekooki-Machida, Y., Kurosawa, M., Nukina, N., Ito, K., Oda, T., and *Tanaka, M.
Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity.

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 9678-9684 (2009).
8.

Tanaka, M., Collins, S.R., Toyama, B.H., and Weissman, J.S.
The Physical Basis of How Prion Conformations Determine Strain Phenotypes.

Nature 442, 585-589 (2006)
9.

Tanaka, M., Chien, P., Yonekura, K., Weissman, J.S.
Mechanism of cross-species prion transmission: An infectious conformation compatible with two highly divergent yeast prion proteins.

Cell 121, 49-62 (2005)
10.

Tanaka, M., Machida, Y., Niu, S., Ikeda, T., Jana, N.R., Doi, H., Kurosawa, M., Nekooki, M., Nukina, N.
Trehalose alleviates polyglutamine-mediated pathology in a mouse model of Huntington disease.

Nat. Med. 10, 148-154 (2004)
11.

Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J.S.
Conformational Variations in an Infectious Protein Determine Prion Strain Differences.

Nature 428, 323-328 (2004)
【総説など】
12.

Sugiyama, S., *Tanaka, M.
Self-propagating amyloid as a critical regulator for diverse cellular functions.

J. Biochem. 155, 345-351 (2014)
13.

Suzuki, G., *Tanaka, M.
Active conversion to the prion state as a molecular switch for cellular adaptation to environmental stress.

Bioessays 35, 12-16 (2013)
14.

*Tanaka, M.
Tracking a toxic polyglutamine epitope.

Nat. Chem. Biol. 7, 861-862 (2011)
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研究課題

新生鎖の立体構造形成を支えるジスルフィド結合形成システムの解明

研究代表者

稲葉 謙次(東北大学・多元物質科学研究所 教授)
研究室HP

研究概要

 ジスルフィド結合の形成は、全タンパク質の約3分の1を占める分泌タンパク質や膜タンパク質の立体構造形成において重要な役割をもつ。真核細胞では、主として、リボソームによって翻訳合成され小胞体膜透過途上新生鎖にジスルフィド結合が導入される。実際、ヒト細胞の小胞体には20種類以上にもおよぶPDI ファミリー酵素とその上流に位置する複数の酸化還元酵素が複雑かつ巧妙な酸化還元ネットワークを形成していると考えられるが、その全容は明らかではない。特に、新生鎖合成のどのタイミングで、どの酸化経路・異性化経路がどのような作用機序のもと正しいジスルフィド結合形成を促すのか、未解決の重要問題である。そこで、新生鎖のジスルフィド結合形成をモニタリングするアッセイシステムを開発すると同時に、ヒト細胞由来の因子から成る無細胞タンパク質合成システム、遺伝子ノックダウン・ノックアウト技術を利用することにより、新生鎖の酸化的フォールディングを促すシステムの作用機序を解明する。また,構造生物学および生物物理学的アプローチにより、これに関わる一連の酵素群の分子機構を詳細に解析し、ヒト細胞におけるジスルフィド結合形成・異性化ネットワークの全容を解明する。

代表的な論文

1.

Maegawa, K., Watanabe, S., Noi, K., Okumura, M., Amagai, Y., Inoue, M., Ushioda, R., Nagata, K., Ogura, T. and Inaba, K.*
The highly dynamic nature of ERdj5 is key to efficient elimination of aberrant protein oligomers through ER-associated degradation
Structure, 6, 646-857(2017)
URL: http://www.cell.com/structure/fulltext/S0969-2126(17)30102-8
雑誌の表紙を飾りました! http://www.cell.com/structure/issue?pii=S0969-2126(16)X0007-X

プレスリリース http://www2.tagen.tohoku.ac.jp/lab/news_press/20170508/

報道: 日経新聞 電子版(2017/05/05)
日経バイオテク ONLINE(2017/05/09)
J-Net21 中小企業ビジネス支援サイト(2017/05/09)
医療NEWS QLifePro(2017/05/10)
日刊工業新聞:https://www.nikkan.co.jp/articles/view/00429701(2017/05/26

2.

Arai, K., Takei, T., Okumura, M., Watanabe, S., Amagai, Y., Asahina, Y., Moroder, L., Hojo, H.*, Inaba, K.* and Iwaoka, M.* (*co-corresponding authors) "
Preparation of selenoinsulin as a long-lasting insulin analog
Angewandte Chemie 56, 5522-5526 (2017)
URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201701654/abstract;jsessionid=9D67E954D8C07ACCE4F16024679DCDCD.f03t04

プレスリリース http://www2.tagen.tohoku.ac.jp/lab/news_press/20170411/

報道: 日経新聞 電子版(2017/05/05)
日経バイオテク ONLINE(2017/05/09)
医療NEWS QLifePro(2017/05/10)
日刊工業新聞(2017/04/14)* 閲覧には会員登録(無料)が必要です
m3.com(2017/04/14)* 閲覧には会員登録(無料)が必要です
マイナビニュース(2017/04/14)
糖尿病ネットワーク(2017/04/14)
大学ジャーナルONLINE(2017/04/16)

3.
  1. Watanabe, S., Harayama, M., Kanemura, S., Sitia, R. and Inaba, K.*
    Structural basis of pH-dependent client binding by ERp44, a key regulator of protein secretion at the ER-Golgi interfaceProc Natl Acad Sci U S A. 114, 3224-3232 (2017)
    URL: http://www.pnas.org/content/114/16/E3224.long
    プレスリリース:http://www2.tagen.tohoku.ac.jp/lab/news_press/20170404/

4.
  1. Kanemura, S., Okumura, M., Yutani, K., Ramming, T., Hikima, T., Appenzeller-Herzog, C. , Akiyama, S. and Inaba, K.*
    Human ER oxidoreductin-1a (Ero1a) undergoes dual regulation through complementary redox interactions with protein-disulfide isomerase
    J. Biol. Chem., 291, 23952-23964 (2016)
    URL: http://www.jbc.org/content/291/46/23952.long

5.

Ryo Ushioda, Akitoshi Miyamotod, Michio Inoue, Satoshi Watanabe, Masaki Okumurae, Ken-ichi Maegawa, Kaiku Uegaki, Shohei Fujii, Yasuko Fukuda, Masataka Umitsu, Junichi Takagi, Kenji Inaba, Katsuhiko Mikoshiba and Kazuhiro Nagata
Redox-assisted regulation of Ca2+ homeostasis in the endoplasmic reticulum by disulfide reductase ERdj5
Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Oct 11;113(41):E6055-E6063. Epub 2016 Sep 30., doi: 10.1073/pnas.1605818113
http://www.pnas.org/content/113/41/E6055

プレスリリース
ジスルフィド還元酵素ERdj5がSERCA2bのジスルフィド結合を還元することを解明
http://www.kyoto-su.ac.jp/news/20161001_345_kenkyu_masu01.html

報道

産経新聞(2016年10月3日付23面)、京都新聞(2016年10月1日付33面)、共同通信(オンライン)、日経プレスリリース(オンライン)

6.
  1. Okumura, M.*, Kadokura, K., Hashimot, S., Yutani, K., Kanemura, S., Hikima, T., Hidaka, Y., Ito, L., Shiba, K., Masui, S., Imai, D., Imaoka, S., Yamaguchi, H.* and Inaba, K.* 
    Inhibition of the functional interplay betweenER oxidoreduclin-1α (Ero1α) and protein disulfide isomerase (PDI) by the endocrine disruptor bisphenol A.
    J. Biol. Chem.289, 27004-27018 (2014).

7.

Kojima, R., Okumura, M., Masui, S., Kanemura, S., Inoue, M., Saiki, M., Yamaguchi, H., Hikima, T., Suzuki, M., Akiyama, S. and Inaba, K.* (These authors contributed equally to this work.)
Radically different thioredoxin domain arrangement of ERp46, an efficient disulfide-bond introducer of the mammalian PDI family.
Structure, 22, 431-443 (2014)

8.

Kojima, R., Okumura, M., Masui, S., Kanemura, S., Inoue, M., Saiki, M., Yamaguchi, H., Hikima, T., Suzuki, M., Akiyama, S. and Inaba, K.*
Radically different thioredoxin domain arrangement of ERp46, an efficient disulfide-bond introducer of the mammalian PDI family.

Structure 22, 431-443 (2014)
9.

Sato, Y., Kojima, R., Okumura, M., Hagiwara, M., Masui, S., Maegawa, K., Saiki, M., Horibe, T., Suzuki, M. and Inaba, K.*
Synergistic cooperation of PDI family member proteins in peroxiredoxin 4-driven oxidative protein folding.

Sci. Rep. 3, 2456 (2013) DOI: 10.1038
10.

Vavassori, S.†, Cortini, M.†, Masui, S.† Sannino, S.†, Anelli, T., Caserta, I. R., Fagioli, C., Fornili, A., Mossuto, M. F., Degano, M, Inaba, K. and Sitia, R.* (†These authors contributed equally to this work.)
A pH-Regulated Quality Control Cycle for Surveillance of Secretory Protein Assembly.

Mol. Cell 50, 783-792 (2013)
11.

Masui, S., Vavassori, S., Fagioli, C., Sitia, R. and Inaba, K.*
Molecular bases of cyclic and specific disulfide interchange between human Ero1 protein and protein-disulfide isomerase (PDI)

J. Biol. Chem. 286, 16262-16271 (2011)
12.

Hagiwara, M., Maegawa, K., Suzuki, M., Ushioda, R., Araki, K., Matsimoto, Y., Hoseki, J., Nagata, K.* and Inaba, K.*
Structural basis of an ERAD pathway mediated by the ER-resident disulfide reductasse ERdj5.
Mol. Cell 41, 432-444 (2011)

13.

Inaba, K.*, Masui, S., Iida, H. Vavassori, S., Sitia, R. and Suzuki, M.
Crystal structures of human Ero1 reveal the mechanisms of regulated and targeted oxidation of PDI.
EMBO J. 29, 3330-3343 (2010)

14.

Inaba, K.*, Murakami, S., Nakagawa, A., Iida, H., Kinjo, H., Ito, K. and Suzuki, M.
Dynamic nature of disulfide bond formation catalysts revealed by crystal structures of DsbB.
EMBO J. 28, 779-791 (2009)

15.

Inaba, K.*, Murakami, S., Suzuki, M., Nakagawa, A., Yamashita, E., Okada, K. and Ito, K.*
Crystal structure of the DsbB-DsbA complex reveals a mechanism of disulfide bond generation.
Cell 127, 789-801 (2006)

16.

Inaba, K., Takahashi, Y. -H., Ito, K. and Hayashi, S.
Critical role of a thiolate-quinone charge transfer complex and its adduct form in de novo disulfide bond generation by DsbB.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 287-292 (2006)

17.

Inaba, K. and Ito, K.
Paradoxical redox properties of DsbB and DsbA in the protein disulfide-introducing reaction cascade.
EMBO J. 21, 2646-2654, (2002)

【総説】
1.

Sato, Y. and Inaba, K.*
Disulfide bond formation network in the biological kingdoms.
FEBS J. 279, 2262-2271 (2012)

2.

Araki, K. and Inaba, K.*
Structure, mechanism and evolution of Ero1 family enzymes.
Antioxid. Redox Signal. 16, 790-799 (2012)

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研究課題

新生鎖の立体構造形成を支えるジスルフィド結合形成システムの細胞生物学的研究

分担研究者

門倉 広(東北大学・多元物質科学研究所 准教授)
研究室HP

研究概要

 タンパク質のジスルフィド結合は2個のシステインが酸化されてできる架橋構造である(図)。多くの分泌タンパク質や膜タンパク質の立体構造形成に重要な役割を果たす。ジスルフィド結合が効率よく形成されないと糖尿病などの疾患の原因となる。よって、その仕組みの理解は、応用の観点からも重要である。真核生物ではリボソーム上で合成されつつサイトゾルから小胞体中へと送り込まれた新生鎖にジスルフィド結合が導入される。この過程はPDIファミリーに属する酵素によって促進されると考えられている。哺乳動物の小胞体にはこのようなPDIファミリーに属する酵素が20種類以上存在する。これらのPDIファミリー酵素はその上流にある酸化還元酵素とともに、小胞体内でネットワークを形成し、新生鎖のジスルフィド結合形成を促進・制御することによって新生鎖の立体構造形成を支えていると予想されるが、まだ、多くのことが不明である。例えば、インスリンは3本のジスルフィド結合をもつ(図)が、小胞体中のどのような酵素がどのような順番でインスリンにジスルフィド結合を導入するのかという基本的なことさえ、現時点では不明である。本研究では、細胞内で進行するジスルフィド結合形成の仕組みを解明するために、まず、リボソーム上で伸長しつつ小胞体に送り込まれてきた新生鎖にジスルフィド結合が形成される過程を観察するためのジスルフィド結合形成モニタリングシステムを構築する。また、様々な、細胞生物学的手法を駆使して新生鎖へのジスルフィド結合の導入に関わる酵素を同定するとともにインスリンやLDL受容体などのタンパク質の個々のジスルフィド結合が形成される仕組みの詳細を解明する。このようなアプローチによって、新生鎖の立体構造形成を支えるジスルフィド結合システムを理解するための基盤となる知見を得る。

代表的な論文

1. Yuichi Tsuchiya, Michiko Saito, Hiroshi Kadokura, Jun-ichi Miyazaki, Fumi Tashiro, Yusuke Imagawa, Takao Iwawaki, Kenji Kohno
IRE1–XBP1 pathway regulates oxidative proinsulin folding in pancreatic β cells
J. Cell Biol. 217 (2018) DOI: 10.1083/jcb.201707143
2. Okumura, M.*, Kadokura, H., Hashimoto, S., Yutani, K., Kanemura, S., Hikima, T., Hidaka, Y., Ito, L., Shiba, K., Masui, S., Imai, D., Imaoka, S., Yamaguchi, H.* and Inaba, K.*
Inhibition of the functional interplay betweenER oxidoreduclin-1α (Ero1α) and protein disulfide isomerase (PDI) by the endocrine disruptor bisphenol A.
J. Biol. Chem. 289, 27004-27018 (2014).
3.

*Kadokura, H., Saito, M., Tsuru, A., Hosoda, A., Iwawaki, T., Inaba, K., *Kohno, K.
Identification of the redox partners of ERdj5 /JPDI, a PDI family member, from an animal tissue. Biochem. Biophys.

Res. Commun. 440, 245-250 (2013)
4.

Chng, S.S., Xue, M., Garner, R.A., Kadokura, H., Boyd, D., Beckwith, J., *Kahne, D.
Disulfide rearrangement triggered by translocon assembly controls lipopolysaccharide export.

Science 337, 1665-1668 (2012)
5.

Sopha P., Kadokura H., Yamamoto Y.H., Takeuchi M., Saito M., Tsuru A., *Kohno K.
A novel mammalian ER-located J-protein, DNAJB14, can accelerate ERAD of misfolded membrane proteins.

Cell Struct. Funct. 37, 177-187 (2012)
6.

Shinya, S., Kadokura, H., Imagawa, Y., Inoue, M., Yanagitani, K., *Kohno, K.
Reconstitution and characterization of the unconventional splicing of XBP1u mRNA in vitro.

Nucleic Acids Res. 39, 5245-5254 (2011)
7.

Yanagitani, K., Kimata, Y., Kadokura, H., *Kohno, K.
Translational pausing ensures membrane targeting and cytoplasmic splicing of XBP1u mRNA.

Science 331, 586-589 (2011)
8.

*Kadokura, H., Beckwith, J.*
Detecting folding intermediates of a protein as it passes through the bacterial translocation channel.

Cell 138, 1164-1173 (2009)
9.

Eser, M., Masip, L., Kadokura, H., Georgiou, G., *Beckwith, J.
Disulfide bond formation by exported glutaredoxin indicates glutathione’s presence in the E. coli periplasm.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 1572-1577 (2009)
10.

Zhou, Y., Cierpicki, T., Jimenez, R. H. F., Lukasik, S. M., Ellena, J.F., Cafiso, D.S., Kadokura, H., Beckwith, J., *Bushweller, J.H.
NMR solution structure of the integral membrane enzyme DsbB: Functional insights into DsbB-catalyzed disulfide bond formation.

Mol. Cell 31, 896-908 (2008)
11.

Kadokura, H., Nichols II, L, *Beckwith, J.
Mutational alterations of the key cis proline residue that cause accumulation of enzyme reaction intermediates of DsbA, a member of the thioredoxin superfamily.

J. Bacteriol. 187, 1519-1522.(2005)
12.

Kadokura, H., Tian, H., Zander, Bardwell, J.C.A., *Beckwith, J.

Snapshots of DsbA in action: Detection of proteins in the process of oxidative folding. Science 303, 534-537.(2004)
13.

Kadokura, H., *Beckwith, J.
Four cysteines of the membrane protein DsbB act in concert to oxidize its substrate DsbA.
EMBO J. 21, 2354-2363 (2002)

【総説】
1.

*Kadokura, H., *Beckwith, J.
Mechanisms of oxidative protein folding in the bacterial cell envelope. Antioxid.
Redox Signal. 13, 1231-1246 (2010)

2.

*Kadokura, H., *Katzen, F., *Beckwith, J.
Protein disulfide bond formation in prokaryotes. Ann.
Rev. Biochem. 72, 111-135 (2003)

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研究課題

mRNAの局在化に働く新生鎖の機能解析

研究代表者

河野 憲二(奈良先端科学技術大学院大学・バイオサイエンス研究科 教授)
研究室HP

研究概要

 小胞体ストレス応答(UPR: Unfolded Protein Response)は真核細胞がその恒常性を維持するために進化的に発達させてきた、小胞体とサイトゾル/核間の情報伝達機構であり、その機構は驚くほど巧みに制御されている。我々は、小胞体膜上のストレスセンサーIRE1の活性化と、標的分子XBP1u mRNAの特殊スプライシング機構に着目し研究を進めた結果、XBP1uが翻訳アレストを起こすことにより、小胞体移行に必要な領域HRがリボソームの外側に露出し、このシグナルを利用して自身のmRNAを小胞体膜上へリクルートし、ストレス下での特殊スプライシングを効率良く起こすことを見出した(図参照)。この発見は、翻訳途上の新生鎖が成熟タンパク質とは異なる機能を持つ点、また翻訳アレストとカップリングしたmRNAの細胞内局在化という点で新しい発見である。本計画研究では、小胞体ストレス応答を効率良く起こすためにmRNAを小胞体膜上に運ぶ仕組みを明らかにすることを目的に、以下の項目を解析する。

(1) 翻訳アレストによるXBP1u mRNAの小胞体膜への標的化機構
(2) 翻訳アレスト機構及びその解除機構の解析
(3) 翻訳アレスト時のmRNAと新生鎖の品質管理機構の解析

代表的な論文

1. Tsuchiya, Y., Saito, M., Kadokura, H., Miyazaki, J., Tashiro, F., Imagawa, Y., Iwawaki, T., and Kohno, K.*
IRE1-XBP1 pathway regulates oxidative proinsulin folding in pancreatic β cells.
J. Cell Biol. 217(4), 1287-1301 (2018) doi: 10.1083/jcb.201707143.
プレスリリース:http://www.naist.jp/pressrelease/2018/03/004316.html
2. Mai, C.T., Le, Q.G., Ishiwata-Kimata, Y., Takagi, H., Kohno, K., and Kimata. Y.* 4-Phenylbutyrate suppresses the unfolded protein response without restoring protein folding in Saccharomyces cerevisiae.
FEMS Yeast Research, 18(2), (2018) doi: 10.1093/femsyr/foy016.
3. Yamaoka, Y., Choi, B.Y., Kim, H., Shin, S., Kim, Y., Jang, S., Song, W.Y., Cho, C.H., Yoon, H.S., Kohno, K., and Lee, Y.*
Identification and functional study of ER stress sensor IRE1 in Chlamydomonas reinhardtii.
Plant J., 94(1), 91-104 (2018) doi: 10.1111/tpj.13844.
4. Tschurtschenthaler, M., Adolph, T.E., Ashcroft, J.W., Niederreiter, L., Bharti, R., Saveljeva, S., Bhattacharyya, J., Flak, M.B., Shih, D.Q., Fuhler, G.M., Parkes, M., Kohno, K., Iwawaki, T., van der Woude, C.J., Harding, H., Smith, A.M. Peppelenbosch, M.P., Targan, S.R., Ron, D., Rosenstiel, P., Blumberg, R.S.*, and Kaser, A.*
Defective ATG16L1-mediated removal of IRE1α drives Crohn's disease-like ileitis.
J. Exp. Med. 214(2), 401-422 (2017) doi: 10.1084/jem.20160791
5. Sato, H., Shiba, Y.*, Tsuchiya, Y., Saito, M., and Kohno, K.* 4μ8C inhibits insulin secretion independent of IRE1α RNase activity.
Cell Struct. Funct. 42(1), 61-70 (2017) doi: 10.1247/csf.17002. Epub 2017 Mar 18. PMID: 28321016
6. Schmitner, N., Kohno, K. and Meyer, D*. Ptf1a+, ela3l- cells are developmentally maintained progenitors for exocrine regeneration following extreme loss of acinar cells in zebrafish larvae.
Dis. Model. Mech. 10(3), 307-321 (2017) doi: 10.1242/dmm.026633
7. Kanda, S., Yanagitani, K.*, Yokota, Y., Esaki, Y., and Kohno, K.* Autonomous translational pausing is required for XBP1u mRNA recruitment to the ER via the SRP pathway.
Proc Natl Acad Sci USA, 113(40), E5885-E5895 (2016) doi: 10.1073/pnas.1604435113, PMID: 27651490
紹介記事
http://bsw3.naist.jp/research/index.php?id=1377
報道
朝日新聞(11月3日朝刊21面), 日刊工業新聞(9月21日朝刊27面)
8. Le, Q.G,, Ishiwata-Kimata, Y., Kohno, K. and Kimata, Y.* Cadmium impairs protein folding in the endoplasmic reticulum and induces the unfolded protein response.
FEMS Yeast Research 16(5), pii: fow049 (1-8) (2016) doi: 10.1093/femsyr/fow049
9. Tsuru, A., Imai, Y., Saito, M., and Kohno, K.
Novel mechanism of enhancing IRE1α-XBP1 signalling via the PERK-ATF4 pathway.
Sci. Rep. Apr 7; 6:24217 (2016) doi: 10.1038/srep24217, PMID:27052593
10. *Hirai, S., Kurashima, H., Nakamura, D., Komatsu, T., Yasuda, Y., Habashita-Obata, S., Ichikawa, S., Katsuta, O., Iwawaki, T., Kohno, K.
2-Phenyl-APB-144-induced retinal pigment epithelium degeneration and its underlying mechanisms.
J. Ocul. Pharmacol. Ther., 31, 570-584, (2015)
11. Mathuranyanon, R., Tsukamoto, T., Takeuchi, A., Ishiwata-Kimata, Y., Tuchiya, Y., Kohno, K., *Kimata, Y.
Tight regulation of the unfolded 1 protein sensor Ire1 by its intramolecularly antagonizing s
ubdomain.
J. Cell Sci.
128(9), 1762-1772 (2015)
12.
  1. Mathuranyanon, R., Tsukamoto, T., Takeuchi, A., Ishiwata-Kimata, Y., Tuchiya, Y., Kohno, K., and *Kimata, Y. 
    Tight regulation of the unfolded 1 protein sensor Ire1 by its intramolecularly antagonizing subdomain. 
    J. Cell Sci. 128(9):1762-72. doi: 10.1242/jcs.164111 (2015)

13.

*Kadokura H., Saito, M., Tsuru, A., *Kohno, K.(7人中7番目)
Identification of the redox partners of ERdj5/JPDI, a PDI family member, from an animal tissue.

Biochem. Biophys. Res. Commun., 18;440(2):245-50. doi: 10.1016/j.bbrc.2013.09.063 (2013)
14.

*Kadokura H., Saito, M., Tsuru, A., Hosoda, A., Iwawaki, T., Inaba, K., and *Kohno, K.
Identification of the redox partners of ERdj5/JPDI, a PDI family member, from an animal tissue.
Biochem Biophys Res Commun. 440, 245-250 (2013)

15.

Adolph, T.E., Kohno, K., and *Blumberg, R.S. (25人中13番目)
Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation.

Nature 503, 272-276 (2013)
16.

*Tsuru, A., Fujimoto, N., Takahashi, S., Saito, M., Nakamura, D., Iwano, M., Iwawaki, T., Kadokura, H., Ron, D., and *Kohno, K.
Negative feedback by IRE1βoptimizes mucin production in goblet cells.

Proc Natl Acad Sci USA 110, 2864-2869 (2013)
17.

Shinya, S., Kadokura, H., Imagawa, Y., Inoue, M., Yanagitani, K., and *Kohno, K.
Reconstitution and characterization of the unconventional slicing of XBP1u mRNA in vitro.

Nucleic Acids Res. 39, 5245-5254 (2011)
18.

Yanagitani, K., Kimata, Y., Kadokura, H. and *Kohno, K.
Translational pausing ensures membrane-targeting and cytoplasmic splicing of XBP1u mRNA.

Science 331, 586-589(2011)
19.

Promlek, T., Ishiwata-Kimata, Y., Shido, M., Sakuramoto, M., Kohno, K. and *Kimata, Y.
Membrane aberrancy and unfolded proteins activate the endoplasmic reticulum-stress sensor Ire1 in different ways.

Mol. Biol. Cell 22, 3520-3532 (2011)
20.

Kimata, Y., and *Kohno, K.
Endoplasmic reticulum stress-sensing mechanisms in yeast and mammalian cells.

Curr. Opin. Cell Biol. 23, 135-142 (2011)
21.

Nakamura, D., Tsuru, A., Ikegami, K., Imagawa, Y., Fujimoto, N., and *Kohno, K.

Mammalian ER stress sensor IRE1β specifically down-regulates the synthesis of secretory pathway proteins.

FEBS Lett. 585, 133-138 (2011)

22.

Yamamoto, Y.H., Kimura, T., Momohara, S., Takeuchi, M., Tani, T., Kimata, Y., Kadokura, H., and *Kohno, K.
A novel ER J-protein DNAJB12 accelerates ER-associated degradation of membrane proteins including CFTR.

Cell Struct. Funct. 35, 107-116 (2010)
23.

*Iwawaki, T., Akai, R., Yamanaka, S., and Kohno, K.
Function of IRE1alpha in the placenta is essential for placental development and embryonic viability.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 16657-16662 (2009)
24.

Yanagitani, K., Imagawa, Y., Iwawaki, T., Hosoda, A., Saito, M., Kimata, Y., and *Kohno, K.
Cotranslational targeting of XBP1 protein to the membrane promotes cytoplasmic splicing of its own mRNA.

Mol. Cell 34, 191-200 (2009)
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研究課題

新生鎖テイルアンカー型タンパク質(TA)の輸送・膜挿入と品質管理

研究代表者

藤木 幸夫(九州大学生体防御医学研究所 特任教授)
研究室HP

研究概要

 総タンパク質の20~30%に及ぶ膜タンパク質は、物質輸送、細胞内情報伝達、生体防御など生命活動に必須な機能を担っている。膜タンパク質のうち、テイルアンカー型タンパク質(TA)は分子内C末端に存在する1つの膜貫通領域により脂質膜にアンカーされる(図1)。リボゾーム上で翻訳される新生鎖TAは、翻訳途上のリボゾーム上の時点からBag6を含む膜貫通ドメイン認識複合体(TRC)複合体を介した認識と運命決定がなされると考えられている(図2、①)。TAの多くが小胞体に輸送されるが、それらは広く知られた翻訳共役型輸送の基質とならず、 ATPase活性を持つTRC40を介したGETシステムにより “post-translational”にサイトゾルを介して小胞体膜へ直接輸送される(図2、②)。一方、我々は最近、哺乳類ペルオキシソーム局在型TAがペルオキシンPex19p依存的かつTRC40非依存的にサイトゾルから直接ペルオキシソームへ輸送されることを見出した(図2、④)。従って、翻訳に共役したフォールディングおよび品質管理(図2、③)を含め、C末端膜貫通ドメイン中の局在化シグナルに依存したTAの翻訳後輸送は、その局在先によって異なる分子機構を必要とし、TAの運命決定はより上流のリボソームでの新生鎖翻訳時において実行されることが予想されている。本計画研究ではTAをモデルとして、翻訳と共役した新生鎖の運命決定機構の解明、および品質管理システムと共役したタンパク質翻訳後選別輸送機構という新たな概念の創出を目指し、以下の2課題を解明する。

(1) 新生鎖TAの認識および翻訳速度調節を伴う品質管理システムの解明
(2) 新生鎖TAのオルガネラ選別輸送および膜挿入機構の解明

代表的な論文

1. Okumoto, K., Ono, T., Toyama, R., Shimomura, A., Nagata, A., and Fujiki Y.
New splicing variants of mitochondrial Rho GTPase-1 (Miro1) transport peroxisomes.
J. Cell Biol., 217, 619-633 (2018). doi: 10.1083/jcb.201708122.
紹介記事(日本語)
日本語記事(PDF)
2. Kinoshita, N., Matsuura, A., and Fujiki Y.
Peroxisome biogenesis: a novel inducible PEX19 splicing variant is involved in early stages of peroxisome proliferation.
J. Biochem. 161, 297-308 (2017).
3. Yagita, Y., Shinohara, K., Liu, Y., and Fujiki Y.
ACBD5 is a peroxisomal tail-anchored protein exposing its acyl-CoA binding domain to the cytosol.
J. Biol. Chem. 292, 691-705 (2017).
4. Imoto, Y., Abe, Y., Okumoto, K., Honsho, M., Kuroiwa, H., Kuroiwa, T., and Fujiki Y.
Defining dynamin-based ring organizing center on the peroxisome-dividing machinery isolated from Cyanidioschyzon merolae..
J. Cell Sci. 130, 853-867 (2017) (Highlighted articleとして掲載)
5. Abe, S., Nagai, T., Masukawa, M., Okumoto, K., Homma, Y., Fujiki Y., and Mizuno, K.
Localization of NDR2 to peroxisomes and its role in ciliogenesis.
J. Biol. Chem. 292, 4089-4098 (2017).
6. Honsho, M., Abe, Y., and Fujiki Y.
Plasmalogen synthesis is spatiotemporally regulated by sensing plasmalogens in the inner leaflet
of plasma membrane.
Sci. Rep. 7, article 43936 (2017).
7. Okumoto, K., Tamura, S., and Fujiki Y.
Blue-Native PAGE: Applications to study on peroxisome biogenesis.
Methods in Mol. Biol. 1595, 197-205 (2017)
8. Liu,Y., Honsho, M., and Fujiki Y.
In vitro PMP import analysis using cell-free synthesized PMP and isolated peroxisomes.
Methods in Mol. Biol. 1595, 207-212 (2017)
9. Okumoto, K., Honsho, M., Liu, Y., and Fujiki Y.
Peroxisomal membrane and matrix protein import using a semi-intact mammalian cell system.
Methods in Mol. Biol. 1595, 213-219 (2017)
10. Fujiki Y.
Functional complementation (version 3.0).
eLS., article A27640 (2017).
11. Hosoi KI, Miyata N, Mukai S, Furuki S, Okumoto K, Cheng EH, Fujiki Y.
The VDAC2-BAK axis regulates peroxisomal membrane permeability.
J Cell Biol. 2017. 216, 709-722. doi: 10.1083/jcb.201605002.
紹介記事(日本語)
日本語記事(PDF)
12. Honsho, M., Yamashita,S., and Fujiki Y.
Peroxisome homeostasis: mechanisms of division and selective degradation of peroxisomes in mammals.
Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1863, 984-991 (2016).
13. Fujiki Y.
Peroxisome biogenesis and human peroxisome-deficiency disorders.
Proc. Jpn. Acad., Ser. B 92: 463-477 (2016).
14. Liu Y., Yagita Y., and Fujiki Y.
Assembly of peroxisomal membrane proteins via the direct Pex19p-Pex3p pathway.
Traffic 17, 433-455 (2016) doi: 10.1111/tra.12376
紹介文
liu-et_al.pdf
15. Yoshida, Y., Niwa, H., Honsho, M., Itoyama, A., and Fujiki, Y.
Pex11p mediates peroxisomal proliferation by promoting deformation of the lipid membrane. Biology Open, 4, 710-721 (2015).
16. Fujiki, Y., Okumoto, K., and Honsho, M.
Protein import into peroxisomes: the principles and methods of studying (version 2.0).
eLS., pp.1-7 (2015). doi: 10.1002/9780470015902.a0002618.pub2
17. Honsho, M., Abe, Y., and Fujiki, Y.
Dysregulation of plasmalogen homeostasis impairs cholesterol biosynthesis.
J. Biol. Chem. 290, 28822-28833 (2015).
18.

Jiang, L., Hara-Kuge, S., Yamashita, S., and Fujiki, Y.
Peroxin Pex14p is the key component for coordinated autophagic degradation of mammalian peroxisomes by direct binding to LC3-II.
Genes Cells 20, 36-49 (2014).

19.

Tamura, S., Matsumoto, N., Takeba, R., and Fujiki, Y.
AAA peroxins and their recruiter Pex26p modulate the interactions of peroxins involved in peroxisomal protein import.
J. Biol. Chem. 289, 24336-24346 (2014).

20.

Miyauchi-Nanri, Y., Mukai, S., Kuroda, K., and Fujiki, Y.
Cul4A-DDB1-Rbx1 E3 ligase controls the quality of the PTS2 receptor Pex7p.
Biochem. J. 463, 65-74 (2014).

21.

Fujiki, Y., Okumoto, K., Mukai, S., Honsho, M., and Tamura, S.
Peroxisome biogenesis in mammalian cells.
Front. Physiol., 5, article 307 (2014).

22.

Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., and Fujiki, Y.
The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.
Autophagy 10, 1549-1564 (2014).

23.

Noguchi, M., Honsho, M., Abe, Y., Toyama, R., Niwa, H., Sato, Y., Ghaedi, K., Rahmanifar, A., Shafeghati, Y., and Fujiki, Y.
Mild reduction of plasmalogens causes rhizomelic chondrodysplasia punctata: Functional characterization of a novel mutation.
J. Hum. Genet. 59, 387-392 (2014).

24.

Fujiki, Y., Okumoto, K., Mukai, S., and Tamura, S.
Molecular basis for peroxisome biogenesis disorders.
In: Molecular Machines Involved in Peroxisomes Maintenance, Berlin, Springer-Verlag, pp. 91-110 (2014).

25.

Fujiki, Y., Itoyama, A., Abe, Y., and Honsho, M.
Molecular complex coordinating peroxisome morphogenesis in Mammalian Cells.
In: Molecular Machines Involved in Peroxisomes Maintenance, Berlin, Springer-Verlag, pp. 391-401 (2014).

26.

Okumoto, K., Noda, H., and Fujiki, Y.
Distinct modes of ubiquitination of peroxisome-targeting signal type 1 (PTS1)-receptor Pex5p regulate PTS1 protein import.
J. Biol. Chem. 289: 14089-14108 (2014).

27.

Honsho, M., Asaoku, S., Fukumoto, K., and *Fujiki, Y.
Topogenesis and homeostasis of fatty acyl-CoA reductase 1.
J. Biol. Chem. 288, 34588-34598 (2013)

28.

Yagita, Y., Hiromasa,T., and *Fujiki, Y.
Tail-anchored PEX26 targets peroxisomes via a PEX19-dependent and TRC40-independent class I pathway.

J. Cell Biol. 200, 651-666 (2013)
29.

Otera, H., and *Fujiki, Y.
Pex5p imports folded tetrameric catalase by interaction with Pex13p.

Traffic 13, 1364-1377 (2012)
30.

*Fujiki, Y., Yagita, Y., and Matsuzaki, T.
Peroxisome biogenesis disorders: molecular basis for impaired peroxisomal membrane assembly.
Biochim. Biophys. Acta- Mol. Basis Dis. 1822, 1337-1342 (2012)

31.

Itoyama, A., Honsho, M., Abe, Y., Moser, A., Yoshida, Y., and *Fujiki, Y.
Docosahexaenoic acid mediates peroxisomal elongation, a prerequisite for peroxisome division.

J. Cell Sci. 125, 589-602 (2012)
32.

Miyata, N., Okumoto, K., Noguchi, M., Mukai, S., and *Fujiki, Y.
AWP1/ZFAND6 functions in Pex5 export by interacting with Cys-monoubiquitinated Pex5 and Pex6 AAA ATPase.

Traffic 13, 168-183 (2012)
33.

Okumoto, K., Misono, S., Miyata, N., Matsumoto, Y., Mukai, S., and *Fujiki, Y.
Cysteine-ubiquitination of peroxisome-targeting-signal type 1 (PTS1)-receptor Pex5p regulates Pex5p recycling.

Traffic 12, 1067-1083 (2011)
34.

Su, J. R., Takeda, K., Tamura, S., *Fujiki. Y., and *Miki, K.
Crystal structure of the conserved N-terminal domain of the peroxisomal matrix protein import receptor, Pex14p.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 417-421(2009)
35.

Matsuzaki, T., and *Fujiki, Y.
The peroxisomal membrane-protein import receptor Pex3p is directly transported to peroxisomes by a novel Pex19p- and Pex16p-dependent pathway.

J. Cell Biol. 183, 1275-1286 (2008)
36.

Matsumoto, N., Tamura, S., and *Fujiki, Y.
The pathogenic peroxin Pex26p recruits the Pex1p-Pex6p AAA-ATPase complexes to peroxisomes.
Nature Cell Biol. 5, 454-460 (2003)

【総説】
1.

*Fujiki, Y.
Functional complementation.
In: Encyclopedia of Life Sciences, John Wiley & Sons, Chichester, UK, in press. (2014)

2.

*Fujiki, Y., Okumoto, K., Mukai, S., and Tamura, S.
Molecular basis for peroxisome biogenesis disorders.
In: Brocard, C. and Hartig, A. (eds) Molecular machines involved in peroxisome biogenesis and maintenance, Springer-Verlag, Wien, Austria. pp. 91-110 (2014)

3.

*Fujiki, Y., Itoyama, A., Abe, Y., and Honsho, M.
Molecular complex coordinating peroxisome morphogenesis.
In: Brocard, C. and Hartig, A. (eds) Molecular machines involved in peroxisome biogenesis and maintenance, Springer-Verlag, Wien, Austria. pp. 391-401 (2014)

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分担研究者

田村 茂彦


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研究課題

新生鎖の生理機能と分子機構

研究代表者

千葉 志信(京都産業大学・総合生命科学部 准教授)
研究室HP

研究概要

 翻訳途上の新生鎖は未成熟の合成中間体であり、生理機能を持たないと信じられてきた。我々は、翻訳途上で自らの翻訳伸長を一時停止(アレスト)させ、そのことを利用して蛋白質の分泌装置や膜組込装置などの活性をモニターし、遺伝子発現の調節を介してこれら蛋白質局在化装置の恒常性を維持する因子(大腸菌SecMおよび枯草菌MifM)を見出した。これらの「働く新生鎖」の発見は、翻訳途上の状態で生理機能を発揮するユニークなタンパク質群が存在することを示した。
 SecMやMifMは、その翻訳途上鎖がリボソームの大サブユニットにあるポリペプチド鎖排出トンネルと特異的な相互作用することで、翻訳伸長を阻害する。一方、リボソームの外では、新生鎖のN末端付近にある分泌シグナルや膜組込シグナルがそれぞれの蛋白質局在化装置と相互作用すると、翻訳アレストは解除される。逆に、局在化装置の活性が低下すると、翻訳アレストが持続する。翻訳アレストの持続は、標的遺伝子の発現を翻訳レベルで活性化する。例えば、MifMは、膜組込装置YidCホモログの一つSpoIIIJによって細胞質膜に組み込まれると、その翻訳アレストは解除されるが、SpoIIIJの活性が低下すると、翻訳アレストが持続し、第二のYidCホモログであるYidC2の発現が誘導される(図 参照)。枯草菌細胞においては、このようなMifMの働きによって、生育に必須である蛋白質膜組込装置の恒常性が維持されている。

働く新生鎖の生理機能と分子機構を理解する上で、翻訳アレストのメカニズムと、その解除機構を理解することが必要である。我々は、
(1) 翻訳アレスト機構の解明
(2) 翻訳アレスト解除機構の解明といった中心的課題に取り組みつつ、
(3) 翻訳アレストを利用した新規モニター因子の探索や構築といった発展的課題にも取り組むことで、働く新生鎖の可能性を模索したいと考えている。

代表的な論文

1. Fujiwara, K., Ito, K., Chiba, S..
MifM-instructed translation arrest involves nascent chain interactions with the exterior as well as the interior of the ribosome.
Sci Rep. 8, 10311. (2018) doi: 10.1038/s41598-018-28628-y.
2. Chadani, Y., Niwa, T., Izumi, T., Sugata, N., Nagao, A., Suzuki, T., Chiba, S., Ito, K. and Taguchi, H.
Intrinsic Ribosome Destabilization Underlies Translation and Provides an Organism with a Strategy of Environmental Sensing.
Mol Cell. 68, 528-539.e5. (2017) doi: 10.1016/j.molcel.2017.10.020.
3.

Yuhei Chadani, Tatsuya Niwa, Shinobu Chiba, Hideki Taguchi, Koreaki Ito
Integrated in vivo and in vitro nascent chain profiling reveals widespread translational pausing
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113 (2016)  doi:10.1073/pnas.1520560113
http://www.pnas.org/content/early/2016/01/27/1520560113.abstract

広報記事
タンパク質合成過程における「緩急のリズム」を実証 -大腸菌遺伝子産物中間状態を網羅的に解析-
http://www.kyoto-su.ac.jp/news/20160205_345_release_ka02.html
http://www.titech.ac.jp/news/2016/033388.html

4.

Sohmen, D., Chiba, S., Shimokawa-Chiba, N., Innis, A., Berninghausen, O., Beckmann, R., Ito, K. and *Wilson, D.
Structure of the Bacillus subtilis 70S ribosome reveals the basis for species-specific stalling.
Nat. Commun. (2015)

5.

Shimokawa-Chiba, N., Kumazaki, K., Tsukazaki, T., Nureki, O., Ito, K. and *Chiba, S.
A hydrophilic microenvironment required for the channel-independent insertase function of YidC.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2015)
6. *Chiba, S. and Ito, K.
MifM monitors total YidC activities of Bacillus subtilis including that of YidC2, the target of regulation.
J Bacteriol. 197, 99-107 (2015)
7.
  1. Nakamori, K., Chiba, S. and *Ito, K.
    Identification of a SecM segment required for export-coupled release from elongation arrest.
    FEBS Lett. 588, 3098-3103 (2014)

8.

Kumazaki, K., Chiba, S., Takemoto, M., Furukawa, A., Nishiyama, K.I., Sugano, Y., Mori, T., Dohmae, N., Hirata, K., Nakada-Nakura, Y., Maturana, A.D., Tanaka, Y., Mori, H., Sugita, Y., Arisaka, F., Ito, K., Ishitani, R., *Tsukazaki, T. and *Nureki, O.
Structural basis of Sec-independent membrane protein insertion by YidC.

Nature, 509, 516-52 (2014)
(These authors contributed equally to this work)
9.

Nakamori, K., Chiba, S. and Ito, K.
Identification of a SecM segment required for export-coupled release from elongation arrest.
FEBS Lett. 588, 3098-3103 (2014)

10.

Chiba, S. and Ito, K.
Multisite ribosomal stalling: A unique mode of regulatory nascent chain action revealed for MifM.

Mol. Cell 47, 863-872 (2012)
11.

Ito, K., Chadani, Y., Nakamori, K., Chiba, S., Akiyama, Y. and Abo, Y.
Nascentome analysis uncovers futile protein synthesis in Escherichia coli.

PLoS ONE 6(12), e28413 (2011)
12.

Saito, A., Hizukuri, Y., Matsuo, E., Chiba, S., Mori, H., Nishimura, O., Ito, K. and Akiyama, Y.
Post-liberation cleavage of signal peptides is catalyzed by the site-2 protease (S2P) in bacteria. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA. 108, 13740-13745 (2011)
13.

Chiba, S., Kanamori, T., Ueda, T., Akiyama, Y., Pogliano, K. and Ito, K.
Recruitment of a species-specific translational arrest module to monitor different cellular processes.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 6073-6078 (2011)

14.

White, R., Chiba, S., Pang, T., Dewey, J. S., Savva, C. G., Holzenburg, A., Pogliano, K. and Young, R.
Holin triggering in real time.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 798-803 (2011)

15.

Chiba, S., Lamsa, A. and Pogliano, K.
A ribosome-nascent chain sensor of membrane protein biogenesis in Bacillus subtilis. EMBO J. 18, 3461-3475 (2009)

【総説・書籍】
1.

Ito, K. and Chiba, S.
Biological significance of nascent polypeptides that stall the ribosome.
Regulatory Nascent Polypeptides (Ed. Ito, K.), Springer Japan, pp 3-20 (2014)

2.

Chiba, S.
MifM, a regulatory nascent chain that monitors membrane protein integration.
Regulatory Nascent Polypeptides (Ed. Ito, K.), Springer Japan, pp 257-277 (2014)

3.

Ito, K. and Chiba, S.
Arrest peptides: cis-acting modulators of translation.
Annu. Rev. Biochem. 82, 171-202 (2013)

4.

Ito, K., Chiba, S. and Pogliano, K.
Divergent stalling sequences sense and control cellular physiology.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 1-5 (2010)

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研究課題

新生鎖の直接観察による翻訳過程の追跡

分担研究者

伊藤 維昭(京都産業大学・シニアリサーチフェロー)
研究室HP

研究概要

 遺伝情報の翻訳は生命現象の根底をなす過程であるが、新生ポリペプチド鎖の伸長過程は、最近になってようやく注目を集めるようになった。我々は、翻訳伸長が決して単調な機械的なプロセスではなく、緩急を伴って起こること、また緩急の制御が新生鎖の動的状態や代謝産物の濃度の変化に応答する能力を持ち得ることに特に興味を持っている。このような新生鎖−リボソーム複合体のもつ自律的な制御能力が、ターゲットとなる遺伝子の発現を制御することを示してきたが、新生鎖自体のフォールディング、局在化、複合体形成などが効率よく起こるためにも働いている可能性の追求にも拡げていきたい。翻訳伸長における減速や一時停止がどの程度一般的に起こっているのかを明らかにするため、合成途上鎖(“nascentome”と呼ぶことを提唱)が末端に共有結合で連結したtRNAをもつことを利用した実験方法により、従来研究の盲点でもあった「新生鎖の直接観察」を実施する。大腸菌プロテオームの網羅的解析を試みており、既に、His6配列をN末端に持つASKAクローンを利用して、大腸菌の遺伝子1,000個以上の翻訳伸長の「実像」を、パルスチェイスin vivo実験と精製因子を用いるin vitro翻訳実験で同時並行的に取得する実験を進めている。実際に翻訳の減速は、多くの遺伝子で予想以上に起こっているようである。In vivoとin vitroでの違いや共通性などからそれらを分類し、翻訳減速の原因と生物学的意義を探る。

代表的な論文

1.

Yuhei Chadani, Tatsuya Niwa, Shinobu Chiba, Hideki Taguchi, Koreaki Ito
Integrated in vivo and in vitro nascent chain profiling reveals widespread translational pausing
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113 (2016)  doi:10.1073/pnas.1520560113
http://www.pnas.org/content/early/2016/01/27/1520560113.abstract

広報記事
タンパク質合成過程における「緩急のリズム」を実証 -大腸菌遺伝子産物中間状態を網羅的に解析-
http://www.kyoto-su.ac.jp/news/20160205_345_release_ka02.html
http://www.titech.ac.jp/news/2016/033388.html

2.

Sohmen, D., Chiba, S., Shimokawa-Chiba, N., Innis, A., Berninghausen, O., Beckmann, R., Ito, K. and *Wilson, D.
Structure of the Bacillus subtilis 70S ribosome reveals the basis for species-specific stalling.
Nat. Commun. (2015)

3.

Shimokawa-Chiba, N., Kumazaki, K., Tsukazaki, T., Nureki, O., Ito, K. and *Chiba, S.
A hydrophilic microenvironment required for the channel-independent insertase function of YidC.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2015)
4.

*Chiba, S. and Ito, K.
MifM monitors total YidC activities of Bacillus subtilis including that of YidC2, the target of regulation.

J Bacteriol. 197, 99-107 (2015)
5.
  1. Nakamori, K., Chiba, S. and *Ito, K.
    Identification of a SecM segment required for export-coupled release from elongation arrest.
    FEBS Lett. 588, 3098-3103 (2014)
6.

Kumazaki, K., Chiba, S., Takemoto, M., Furukawa, A., Nishiyama, K.I., Sugano, Y., Mori, T., Dohmae, N., Hirata, K., Nakada-Nakura, Y., Maturana, A.D., Tanaka, Y., Mori, H., Sugita, Y., Arisaka, F., Ito, K., Ishitani, R., *Tsukazaki, T. and *Nureki, O.
Structural basis of Sec-independent membrane protein insertion by YidC.
Nature, 509, 516-52 (2014)
(These authors contributed equally to this work)

7.

*Mio K, Tsukazaki T, Mori H, Kawata M, Moriya T, Sasaki Y, Ishitani R, Ito K, *Nureki O and *Sato C.
Conformational variation of the translocon enhancing chaperone SecDF.
J Struct Funct Genomics. 15, 107-15 (2014)

8.

Nakamori, K., Chiba, S. and Ito, K.
Identification of a SecM segment required for export-coupled release from elongation arrest.

FEBS Lett. 588, 3098-3103 (2014)
9.

Kumazaki, K*., Chiba, S*., Takemoto, M., Furukawa, A., Nishiyama, K.I., Sugano, Y., Mori, T., Dohmae, N., Hirata, K., Nakada-Nakura, Y., Maturana, A.D., Tanaka, Y., Mori, H., Sugita, Y., Arisaka, F., Ito, K., Ishitani, R., Tsukazaki, T. and Nureki, O.
Structural basis of Sec-independent membrane protein insertion by YidC.
Nature 509, 516-520(2014)
(*Equal contribution authors)

10.

Lim, B., Miyazaki, R., Neher, S., Siegele, D.A., Ito, K., Walter, P., Akiyama, Y., Yura, T. and Gross, C.A.
Heat shock transcription factor σ32 co-opts the signal recognition particle to regulate protein homeostasis in E. coli.
PLoS Biol.11(12), e1001735(2013)

11.

Chiba, S. and Ito, K.
Multisite ribosomal stalling: A unique mode of regulatory nascent chain action revealed for MifM.
Mol. Cell 47, 863-872 (2012)

12.

Chadani, Y., Ito, K., Kutsukake, K. and Abo T.
ArfA recruits release factor 2 to rescue stalled ribosomes by peptidyl-tRNA hydrolysis in Escherichia coli.
Mol. Microbiol. 86, 37-50 (2012)

13.

Ito, K., Chadani, Y., Nakamori, K., Chiba, S., Akiyama, Y. and Abo, Y.
Nascentome analysis uncovers futile protein synthesis in Escherichia coli.
PLoS ONE 6(12), e28413 (2011)

14.

Saito, A., Hizukuri, Y., Matsuo, E., Chiba, S., Mori, H., Nishimura, O., Ito, K. and Akiyama, Y.
Post-liberation cleavage of signal peptides is catalyzed by the site-2 protease (S2P) in bacteria.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 13740-13745 (2011)

15.

Tsukazaki, T, Mori, H., Echizen, Y., Ishitani, R., Fukai, S., Tanaka, T., Perederina, A., Vassylyev, D. G., Kohno, T., Maturana, A. D., Ito, K., and Nureki, O.
Structure and function of a membrane component SecDF that enhances protein export.

Nature 474, 235–238 (2011)
16.

Chiba, S., Kanamori, T., Ueda, T., Akiyama, Y., Pogliano, K. and Ito, K.
Recruitment of a species-specific translational arrest module to monitor different cellular processes.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 6073-6078 (2011)
【総説】
1.

Ito, K. and Chiba, S.
Biological significance of nascent polypeptides that stall the ribosome.
Regulatory Nascent Polypeptides (Ed. Ito, K.), Springer Japan, pp. 3-20 (2014)

2

Ito, K.
Analyzing the nascentome (polypeptidyl-tRNAs), the dynamic hub of translation.
Regulatory Nascent Polypeptides (Ed. Ito, K.), Springer Japan, pp. 135-148 (2014)

3

Ito, K. and Chiba, S.
Arrest peptides: cis-acting modulators of translation.
Annu. Rev. Biochem. 82, 171-202 (2013)

4

Ron, D. and Ito, K.
A translational pause to localize (Perspective).
Science 331, 543-544 (2011)

5

Ito, K., Chiba, S. and Pogliano, K.
Divergent stalling sequences sense and control cellular physiology.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 1-5 (2010)