組織

公募研究

 

 

研究課題

新生鎖の合成速度を段階的に変える翻訳システムの創成

  Developing a translation system that has a variable speed of the nascent
  chain elongation

 

研究代表者

姚 閔(北海道大学大学院 先端生命科学研究院 X線構造生物学研究室)
研究室HP

研究概要

リボソームによる新生鎖合成のメカニズムが明らかになってきた現在、その得られた情報をもとに、新生鎖合成を自在に制御できるような次世代型新生鎖合成システムの創成が期待されます。我々は、新生鎖合成に必要なエネルギーを供給するGTPase(開始因子、伸長因子など)を運搬する真核型ストーク複合体の構造解析に成功しました。このストーク複合体は、リボソーム本体に固く結合した足場タンパク質P0(バクテリアではL10)に、複数の翻訳因子と結合するタンパク質P1二量体の3個(大腸菌ではL12二量体が2個)結合した複合体(P0[P1]2[P1]2[P1]2)です。その構造をもとに、P0の改変によって様々なP1欠損ストークを作製し、各P1二量体は独立して翻訳因子を運搬することを明らかにしました。さらには、バクテリア型と真核型のストーク構成成分は交換可能であることも示されました。大腸菌と比べて真核生物の新生鎖合成速度(ターンオーバータイム)は、10分の1であることが知られており、その差は、ストークの性質とGTPase、特に運搬頻度の高い伸長因子EF-2とEF-1α(バクテリアではEF-TuとEF-G)の種差によるものと考えられる。ここで、我々は、大腸菌リボソームのストークの一部を真核型に変換することによって、大腸菌を使いながらも、真核型伸長因子をリクルートできる低速翻訳システムを実現することができると考えました。成功すれば、大腸菌を用いた可溶化発現の改善が期待できます。以上、本研究課題では、大腸菌L10の改変により、真核の性質を持つキメラ型L10を作製し、それに結合するL12二量体又はP1二量体の個数を調節することで、新生鎖の合成速度を人工的に数段階調節できる翻訳システムを創出することを試みます。

代表的な論文

1. Takehito Tanzawa, Koji Kato, Dylan Girodat, Toyoyuki Ose, Yuki Kumakura, Hans-Joachim Wieden, Toshio Uchiumi, Isao Tanaka, and Min Yao The C-terminal helix of ribosomal P stalk recognizes a hydrophobic groove of elongation factor 2 in a novel fashion.
Nucleic Acids Research. 46, 3232-3244 (2018)
2. Meirong Chen, Koji Kato, Yume Kubo, Yoshikazu Tanaka, Yuchen Liu, Feng Long, William Whitman, Pascal Lill, Christos Gatsogiannis, Stefan Raunser,Nobutaka Shimizu, Akira Shinoda, Akiyoshi Nakamura, Isao Tanaka, and Min Yao.
Structural basis for the tRNA-dependent cysteine biosynthesis
Nature Communications. 8, 1512 (2017)
3. Minghao Chen, Shin-ichi Asai, Shun Narai, Shusuke Nambu, Naoki Omura, Yuriko Sakaguchi, Tsutomu Suzuki, Masao Ikeda-Saito, Kimitsuna Watanabe, Min Yao, Naoki Shigi, and Yoshikazu Tanaka.
Biochemical and structural characterization of oxygen-sensitive 2-thiouridine synthesis catalyzed by an iron-sulfur protein TtuA
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 114, 4954-4959 (2017)
4. S Kimura, T Suzuki, M Chen, K Kato, J Yu, A Nakamura, I Tanaka and *M Yao.
Template-dependent nucleotide addition in the reverse (3'-5') direction by Thg1-like protein
Science Advances, 2, e1501397 (2016)
5. N Asano, K Kato, A Nakamura, K Komoda, I Tanaka, *M Yao.
Structural and functional analysis of the Rpf2-Rrs1 complex in ribosome biogenesis
Nucleic Acid Res., 43, 4746-4757. (2015)
6. T Suzuki, A Nakamura, K Kato, D Soll, I Tanaka, K Sheppard, and *M Yao.
Structure of the Pseudomonas aeruginosa transamidosome reveals unique aspects of bacterial tRNA-dependent asparagine biosynthesis
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112, 382-387. (2015)
7. A Zheng, J Yu, R Yamamoto, T Ose, I Tanaka and *M Yao.
X-ray structures of eIF5B and eIF5B-eIF1A complex: conformational flexibility of eIF5B restricted on the ribosome by interaction with eIF1A
Acta Cryst., D70, 3090-3098. (2014)
8. Y Liu, A Nakamura, Y Nakazawa, N Asano, K. A Ford, M. J Hohn, I Tanaka, *M Yao and *D Söll.
Ancient translation factor is essential for tRNA-dependent cysteine biosynthesis in methanogenic archaea
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111, 10520-10525. (2014)
9. A Nakamura, T Nemoto, I U Heinemann, K Yamashita, T Sonoda, K Komoda, I Tanaka, *D Soll *M. Yao.
Structural basis of reverse nucleotide polymerization
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110, 20970-20975. (2013)
10. K. Yamashita, Y. Zhou, I. Tanaka and *M. Yao
New model-fitting and model-completion programs for automated iterative nucleic acid refinement
Acta Cryst., D69, 1171-1179 (2013)
11. M Englerta, S Xia, C Okada, A Nakamura, V Tanavde, M. Yao S. H Eom, W. H Konigsberg,*D Söll and *JWang.
Structural and mechanistic insights into guanylylation of RNA-splicing ligase RtcB joining RNA between 3′-terminal phosphate and 5′-OH
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, 15235-15240. (2012)
12. N Nomura, T Honda, K Baba, T Naganuma, T Tanzawa, F Arisaka, M Noda, S Uchiyama, I Tanaka, *M Yao and *T Uchiumi.
Archaeal ribosomal stalk protein interacts with translation factors in a nucleotide-independent manner via its conserved C terminus
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, 3748-3753. (2012)
13. S.-Q Hu, Y-G. Gao, K Tajima, N Sunagawa, Y Zhou, S Kawano, T Fujiwara, T Yoda, D Shimura, Y Satoh, M Munekata, I Tanaka and *M Yao.
Structure of bacterial cellulose synthase subunit D octamer with four inner passageways,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 17957-17961. (2010)
14. J Yu, Y Zhou, I Tanaka and *M Yao.
Roll:a new algorithm for the detection of protein pockets and cavities with a rolling probe sphere.
Bioinformatics, 26, 46-52. (2010)
15. #A Nakamura, #M Yao, S Chimnaronk, N Sakai and *I Tanaka.
Ammonia Channel Couples Glutaminase with Transamidase Reactions in GatCAB
Science, 312, 1954-1958. (2006) #These authors contributed equally to this work.
16. M Sokabe, M Yao, N Sakai, S Toya and *I Tanaka.
Structure of archaeal translational initiation factor 2 βγ-GDP reveals significant conformational change of the β-subunit and switch 1 region
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 13016-13021. (2006)
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研究課題

分子シャペロンの基質選択と活性発現における動的構造基盤

研究代表者

齋尾 智英(北海道大学 大学院理学研究院 化学部門 構造化学研究室)
研究室HP

研究概要

分子シャペロンはタンパク質のミスフォールディングや凝集を防ぐことによって、細胞内でのタンパク質の品質管理、特に新生鎖の折りたたみや輸送において重要な働きを担っている。細胞内には複数種のシャペロンが存在し、それぞれが固有の機能を発揮しながら共同的に働いているが、その詳細なメカニズムは明らかになっていない。特にシャペロンの活性発現や基質選択のメカニズムについては特に知見が乏しい。私たちはこれまでにTrigger Factor (TF) シャペロンなどの大腸菌細胞質シャペロンを対象とした研究を推進し、溶液NMR法によって基質タンパク質との複合体立体構造を決定し、シャペロンによる変性状態の基質タンパク質の認識機構について明らかにしてきた。それによってシャペロンは基質の疎水性領域を保護し、疎水性領域を引き離すことによって基質の凝集やミスフォールディングを抑制することが明らかになった。 しかし変性状態の基質との複合体立体構造解析のみでは、新生鎖の折りたたみや輸送におけるシャペロンの動的な作用機序について明らかにすることは難しい 。また、シャペロンによる基質認識は緩く、多様なアミノ酸配列が認識されることも示され、立体構造情報のみでは活性発現の特異性や基質選択性について説明できないことも明らかになった。そこで今後は、NMRを主体とした複合的なアプローチによって、シャペロンの活性発現メカニズム、特にTFシャペロンによる基質タンパク質の折りたたみ補助のメカニズムと特異性発現のメカニズムの詳細を明らかにすることを目指す。

代表的な論文

1. Structural insight into proline cis/trans isomerization of unfolded proteins catalyzed by the Trigger Factor chaperone
S Kawagoe, H Nakagawa, H Kumeta, K Ishimori, T Saio
Journal of Biological Chemistry, in press
http://www.jbc.org/content/early/2018/08/09/jbc.RA118.003579
2. Saio T, Kawagoe S, Ishimori K, Kalodimos CG.
Oligomerization of a molecular chaperone modulates its activity.
Elife. 2018 May 1;7. pii: e35731. doi: 10.7554/eLife.35731.
3. Huang C, Rossi P, Saio T, *Kalodimos CG.
Structural basis for the antifolding activity of a molecular chaperone.
Nature, 537, 202-206. (2016)
4. Saio T, Ogura K, Kumeta H, Kobashigawa Y, Shimizu K, Yokochi M, Kodama K, Yamaguchi H, Tsujishita H, *Inagaki F.
Ligand-driven conformational changes of MurD visualized by paramagnetic NMR.
Sci Rep, 5, 16685. (2015)
5. Saio T †, Guan X†, Rossi P, Economou A, *Kalodimos CG. (†Equal contribution)
Structural Basis for Protein anti-Aggregation Activity of the Trigger Factor Chaperone.
Science, 344, 1250494. (2014)
6. Kobashigawa Y†,Saio T †, Ushio M†, Sekiguchi M, Yokochi M, Ogura K, *Inagaki F. (†Equal contribution)
Convenient method for resolving degeneracies due to symmetry of the magnetic susceptibility tensor and its application to pseudo contact shift-based protein-protein complex structure determination.
J Biomol NMR, 53, 53-63. (2012)
7. Saio T, Ogura K, Shimizu K, Yokochi M, Burke TR Jr, *Inagaki F.
An NMR strategy for fragment-based ligand screening utilizing a paramagnetic lanthanide probe.
J Biomol NMR, 51, 395-408. (2011)
8. Saio T, Yokochi M, Kumeta H, *Inagaki F.
PCS-based structure determination of protein-protein complexes.
J Biomol NMR, 46, 271-280. (2010)
9. Saio T, Ogura K, Yokochi M, Kobashigawa Y, Inagaki F.
Two-point anchoring of a lanthanide-binding peptide to a target protein enhances the paramagnetic anisotropic effect.
J Biomol NMR, 44, 157-166. (2009)

総説

T Saio, *F Inagaki.
NMR structural biology using paramagnetic lanthanide probe.
In "Advanced Methods in Structural Biology", Ed. Senda T, Maenaka K, 315-340, Springer. (2016)


*斉尾智英
トリガーファクターシャペロンによる動的基質認識の構造基盤.
生化学, 88, 406-610. (2016)

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研究課題

シロイヌナズナCGS1遺伝子における翻訳停止とmRNA分解機構の研究

研究代表者

内藤 哲(北海道大学・大学院農学研究院 教授)
研究室HP

研究概要

シロイヌナズナCGS1遺伝子は高等植物におけるメチオニン生合成の鍵となる段階を触媒するシスタチオニンγ-シンターゼ (CGS) をコードする。CGSはアロステリック酵素ではなく,CGS1遺伝子の発現は,メチオニンの代謝産物であるS-アデノシルメチオニン (SAM) に応答した翻訳伸長の一時停止(翻訳アレスト)と,これと共役したmRNA分解によってフィードバック制御される。翻訳アレストには,MTO1領域と名付けた十数アミノ酸残基の領域がシス配列として機能し,翻訳アレストとmRNA分解はコムギ胚芽試験管内翻訳系で再現される。翻訳アレストはMTO1領域直後のSer-94コドンで起こり,Ser-94までを翻訳したペプチジル-tRNAが蓄積するが,やがて翻訳は再開される。リボソームが転座前の段階にあるときに翻訳アレストが引き起こされ,このとき,MTO1領域を含む新生鎖はリボソーム出口トンネル内で縮んだコンフォメーションをとるとともに,26S rRNAにおいてもコンフォメーション変化起こる。
本研究は,これらの知見に着目し,(i) SAMがいかにして翻訳停止を引き起こし,(ii) 翻訳停止がいかにしてmRNA分解につながるのかについて,以下の作業仮説に基づいて解析を進める:
(i) SAMは翻訳アレストにおいて,どこで,どのように作用しているのか?

  • ・リボソームの出口トンネル内で,新生ペプチドとSAMが相互作用しているのではないか。
  • ・出口トンネル狭窄部位を構成するuL4とuL22タンパク質のβ-loopが翻訳アレストに機能しているのではないか。
  • ・Ser-94での翻訳アレストに先だって,新生ペプチドもしくはrRNAにコンフォメーション変化が起きているのではないか。
(ii) SAMに応答したCGS1 mRNA分解は,no-go decay (NGD) によるものか?
  • ・植物においても,NGDおよびリボソーム品質管理機構 (RQC) が作動しているのではないか。
  • ・RQC, NGDがCGS1 mRNA分解で作動しているのではないか。

代表的な論文

1. *Yamashita Y, Takamatsu S, Glasbrenner M, Becker T, Naito S, *Beckmann R.
Sucrose sensing through nascent peptide-meditated ribosome stalling at the stop codon of Arabidopsis bZIP11 uORF2.
FEBS Lett., in press. (doi: 10.1002/1873-3468.12634)
2. Tanaka M, Sotta N, Yamazumi Y, Yamashita Y, Miwa K, Murota K, Chiba Y, Hirai MY, Akiyama T, Onouchi H, *Naito S, *Fujiwara T.
The Minimum Open Reading Frame, AUG-Stop, Induces Boron-Dependent Ribosome Stalling and mRNA Degradation.
Plant Cell, 28, 2830-2849. (2016).
3. Ebina I, Takemoto-Tsutsumi M, Watanabe S, Koyama H, Endo Y, Kimata K, Igarashi T, Murakami K, Kudo R, Ohsumi A, Noh AL, Takahashi H, Naito S, *Onouchi H.
Identification of novel Arabidopsis thaliana upstream open reading frames that control expression of the main coding sequences in a peptide sequence-dependent manner.
Nucleic Acids Res., 43, 1562-1576. (2015).
4. Yamashita Y, Kadokura Y, Sotta N, Fujiwara T, Takigawa I, Satake A, Onouchi H, *Naito S.
Ribosomes in a stacked array: Elucidation of the step in translation elongation at which they are stalled during S-adenosyl-L-methionine-induced translation arrest of CGS1 mRNA.
J. Biol. Chem., 289, 12693-12704. (2014).
5. Yamashita Y, Lambein I, Kobayashi S, Onouchi H, Chiba Y, *Naito S.
A halt in poly(A) shortening during S-adenosyl-L-methionine-induced translation arrest in CGS1 mRNA of Arabidopsis thaliana.
Genes Genet. Syst., 88, 241-249. (2013).
6. Onoue N, Yamashita Y, Nagao N, Goto DB, Onouchi H, *Naito S.
S-Adenosyl-L-methionine induces compaction of nascent peptide chain inside the ribosomal exit tunnel upon translation arrest in the Arabidopsis CGS1 gene.
J. Biol. Chem., 286, 14903-14912. (2011).
7. Murota K, Hagiwara-Komoda Y, Komoda K, Onouchi H, Ishikawa M, *Naito S.
Arabidopsis cell-free Extract, ACE, a new in vitro translation system derived from Arabidopsis callus cultures.
Plant Cell Physiol., 52, 1443-1453. (2011).
8. Onouchi H, Haraguchi Y, Nakamoto M, Kawasaki D, Nagami-Yamashita Y, Murota K, Kezuka- Hosomi A, Chiba Y, *Naito S.
Nascent peptide-mediated translation elongation arrest of Arabidopsis thaliana CGS1 mRNA occurs autonomously.
Plant Cell Physiol., 49, 549-556. (2008).
9. Haraguchi Y, Kadokura Y, Nakamoto M, Onouchi H, *Naito S.
Ribosome stacking defines CGS1 mRNA degradation sites during nascent peptide-mediated translation arrest.
Plant Cell Physiol., 49, 314-323. (2008).
10. Onouchi H, Nagami Y, Haraguchi Y, Nakamoto M, Nishimura Y, Sakurai R, Nagao N, Kawasaki D, Kadokura Y, *Naito S
Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis.
Genes Dev., 19, 1799-1810. (2005).
11. Yoshii M, Nishikiori M, Tomita K, Yoshioka N, Kozuka R, Naito S, *Ishikawa M.
The Arabidopsis cucumovirus multiplication 1 and 2 loci encode translation initiation factors 4E and 4G.
J. Virol., 78, 6102-6111. (2004).
12. Komoda K,Naito S, *Ishikawa M.
Replication of plant RNA virus genomes in a cell-free extract of evacuolated plant protoplasts.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 1863-1867. (2004).
13. Lambein I, Chiba Y, Onouchi H, *Naito S.
Decay kinetics of autogenously regulated CGS1 mRNA that codes for cystathionine γ-synthase in Arabidopsis thaliana.
Plant Cell Physiol., 44, 893-900. (2003).
14. Chiba Y, Sakurai R, Yoshino M, Ominato K, Ishikawa M, Onouchi H, *Naito S.
S-adenosyl- L-methionine is an effector in the posttranscriptional autoregulation of the cystathionine γ-synthase gene in Arabidopsis.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 10225-10230. (2003).
15. Ominato K, Akita H, Suzuki A, Kijima F, Yoshino T, Yoshino M, Chiba Y, Onouchi H, *Naito S.
Identification of a short highly conserved amino acid sequence as the functional region required for posttranscriptional autoregulation of the cystathionine γ-synthase gene in Arabidopsis.
J. Biol. Chem., 277, 36380-36386. (2002).
16. Chiba Y, Ishikawa M, Kijima F, Tyson RH, Kim J, Yamamoto A, Nambara E, Leustek T, Wallsgrove RM, *Naito S.
Evidence for autoregulation of cystathionine γ-synthase mRNA stability in Arabidopsis.
Science, 286, 1371-1374. (1999).

総説

山下由衣,尾之内均,内藤 哲
止まって働くリボソーム – 新生ペプチドが司る植物の細胞内恒常性維持機構.
化学と生物, 54, 191-197 (2016).

Yamashita Y, Onoue N, Murota K, Onouchi H, Naito S.
Translation elongation arrest induced by S-adenosyl-L-methionine-sensing peptide in plants.
In “Regulatory Nascent Peptides”, Ed. Koreaki Ito, 187-201, Springer (2014).
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研究課題

「疾患に関わる非AUG型上流ORFの情報工学的網羅同定法の開発」

研究代表者

高橋 広夫(千葉大学・大学院園芸学研究科・応用生命化学領域 准教授)
研究室HP

研究概要

真核生物の10-50%のmRNAには、non-coding RNA (ncRNA) 領域である5'非翻訳領域に上流ORF (uORF)と呼ばれる短いORFが存在するが、その生物学的意義は軽視されてきた。しかし、近年、一部のuORFは下流のmain ORF (mORF)の翻訳制御に関わっていることが分かってきた。そこで、ペプチド配列が進化的に保存されているuORF (conserved peptiede uORF: CPuORF)なら機能が保存されていると仮定し、このようなCPuORFを網羅的に抽出するために、バイオインフォマティクスに基づく新しい方法論 (BAIUCAS法)を開発した。本手法をモデル植物に応用したところ、CPuORFを新たに18個同定できた(9)。しかも、実験的にこれらのuORFが翻訳制御に関わっていることを証明することに成功している(1,2)。これらのuORFペプチドは、新生鎖の状態で翻訳アレストに寄与していると期待される。uORF領域はコード領域と比して多様性に富むため、近縁種間で比較するための新方法論が必要である。さらに、5'非翻訳領域には、通常のuORFだけでなく、非AUGを開始コドンとする非AUG-uORFが存在し、潜在的に、非AUG-uORFも多数存在すると予想されるが情報学的な網羅解析はこれまでに行われていない。
そこで、本研究では、以下の①~③を実施することで、主として、情報学的な観点から網羅的なCPuORFの探索・解析を介して、翻訳アレストに関する規則性や恒常性維持機構との関連性のメカニズム解明に取り組む。

① 非AUG-uORFに対応させたCPuORFの網羅同定法の高度化・応用 (図参照)
② 統計・機械学習に基づくクラスタリング等によるCPuORFの分類・体系化
③ ヒトのCPuORFと疾患との関連解析・実験的な機能検証

代表的な論文

1. Vial-Pradel S., Keta S., Nomoto M., Luo L., Takahashi H., Suzuki M., Yokoyama Y., Sasabe M., Kojima S., Tada Y., *Machida Y.and *Machida C.
Arabidopsis zinc-finger-like protein ASYMMETRIC LEAVES2 (AS2) and two nucleolar proteins maintain gene body DNA methylation in the leaf polarity gene ETTIN (ARF3),
Plant Cell Physiol.(DOI: 10.1093/pcp/pcy031)
2. Hayashi N., Sasaki S., Takahashi H., Yamashita Y., Naito S., *Onouchi H. Identification of Arabidopsis thaliana upstream open reading frames encoding peptide sequences that cause ribosomal arrest.
Nucleic Acids Res., 45, 8844-8858, (2017) DOI: 10.1093/nar/gkx528
3. Ebina I., Takemoto-Tsutsumi M., Watanabe S., Koyama H., Endo Y., Kimata K., Igarashi T., Murakami K., Kudo R., Osumi A., Noh A. L., Takahashi H., Naito S., and *Onouchi H.
Identification of novel Arabidopsis thaliana upstream open reading frames that control expression of the main coding sequences in a peptide sequence-dependent manner.
Nucleic Acids Res., 43(3), 1562-1576 (2015)
4. Noh A. L., Watanabe S., Takahashi H., Naito S., and *Onouchi H.
An upstream open reading frame represses expression of a tomato homologue of Arabidopsis ANAC096, a NAC domain transcription factor gene, in a peptide sequence-dependent manner.
Plant Biotechnol., 32(2), 157-163 (2015)
5. *Takahashi H., Kaniwa N., Saito Y., Sai K., Hamaguchi T., Shirao K., Shimada Y., Matsumura Y., Ohtsu A., Yoshino T., Doi T., Takahashi A., Odaka Y., Okuyama M., Sawada J., Sakamoto H., and Yoshida T.
Construction of possible integrated predictive index based on EGFR and ANXA3 polymorphisms for chemotherapy response in fluoropyrimidine-treated Japanese gastric cancer patients using a bioinformatic method.
BMC Cancer, 15(1), 718 (2015)
6. *Takahashi H., Sai K., Saito Y., Kaniwa N., Matsumura Y., Hamaguchi T., Shimada Y., Ohtsu A., Yoshino T., Doi T., Okuda H., Ichinohe R., Takahashi A., Doi A., Odaka Y., Okuyama M., Saijo N., Sawada J., Sakamoto H., and Yoshida T.
Application of a combination of a knowledge-based algorithm and 2-stage screening to hypothesis-free genomic data on irinotecan-treated patients for identification of a candidate single nucleotide polymorphism related to an adverse effect.
PLOS ONE, 9(8), e105160 (2014)
7. Takahashi A., Nakayama R., Ishibashi N., Doi A., Ichinohe R., Ikuyo Y., Takahashi T., Marui S., Yasuhara K., Nakamura T., Sugita S., Sakamoto H., Yoshida T., Hasegawa T., and *Takahashi H.
Analysis of gene expression profiles of soft tissue sarcoma using a combination of knowledge-based filtering with integration of multiple statistics.
PLOS ONE, 9(9), e106801 (2014)
8. Takahashi H., Iwakawa H., Ishibashi N., Kojima S., Matsumura Y., Prananingrum P., Iwasaki M., Takahashi A., Ikezaki M., Luo L., Kobayashi T., Machida Y. and Machida C.
Meta-analyses of microarrays of Arabidopsis asymmetric leaves1 (as1), as2 and their modifying mutants reveal a critical role for the ETT pathway in stabilization of adaxial-abaxial patterning and cell division during leaf development.
Plant Cell Physiol., 54(3), 418-431 (2013)
9. Iwasaki M., Takahashi H., Iwakawa H., Nakagawa A., Ishikawa T., Tanaka H., Matsumura Y., Pekker I., Eshed Y., Pradel S. V., Ito T., Watanabe Y., Ueno Y., Fukazawa H., Kojima S., Machida Y. and Machida C.,
Dual regulation of ETTIN (ARF3) gene expression by AS1-AS2, which maintains the DNA methylation level, is involved in stabilization of leaf adaxial-abaxial partitioning in Arabidopsis.
Development, 140(9), 1958-1969 (2013)
10. *Takahashi H., Nakayama R., Hayashi S., Nemoto T., Murase Y., Nomura K., Takahashi T., Kubo K., Marui S., Yasuhara K., Nakamura T., Sueo T., Takahashi A., Tsutsumiuchi K., Ohta T., Kawai A., Sugita S., Yamamoto S., Kobayashi T., Honda H., Yoshida T., Hasegawa T..
Macrophage migration inhibitory factor and stearoyl-CoA desaturase 1: Potential prognostic markers for soft tissue sarcomas based on bioinformatics analyses.
PLOS ONE, 8(10), e78250 (2013)
11. Takahashi H., Takahashi A., Naito S. and Onouchi H.,
BAIUCAS: a novel BLAST-based algorithm for the identification of upstream open reading frames with conserved amino acid sequences, and its application to the Arabidopsis thaliana genome.
Bioinformatics, 28(17), 2231-2241 (2012)
12. Sano M., Aoyagi K., Takahashi H., Kawamura T., Mabuchi T., Igaki H., Tachimori Y., Kato H., Ochiai A., Honda H., Nimura Y., Nagino M., Yoshida T., Sasaki H.
Forkhead box A1 transcriptional pathway in KRT7-expressing esophageal squamous cell carcinomas with extensive lymph node metastasis.
Int. J. Oncol., 36(2), 321-330 (2010)
13. Nakayama R., Nemoto T., Takahashi H., Ohta T., Kawai A., Seki K., Yoshida T., Toyama Y., *Ichikawa H., Hasegawa T.
Gene expression analysis of soft tissue sarcomas: characterization and reclassification of malignant fibrous histiocytoma.
Modern Pathol., 20(7), 749-759, 2007
14. Takahashi H., Honda H.,
Modified signal-to-noise: a new simple and practical gene filtering approach based on the concept of projective adaptive resonance theory (PART) filtering method.
Bioinformatics, 22(13), 1662-1664 (2006)
15. Takahashi H., Nemoto T., Yoshida T., Honda H., Hasegawa T.
Cancer diagnosis marker extraction for soft tissue sarcomas based on gene expression profiling data by using projective adaptive resonance theory (PART) filtering method.
BMC Bioinformatics, 7, 399 (2006)
16. Takahashi H., Kobayashi T., Honda H.,
Construction of robust prognostic predictors by using projective adaptive resonance theory as a gene filtering method,
Bioinformatics, 21(2), 179-186 (2005)

総説

1. 高橋広夫、岩川秀和、尾之内均、小島晶子、町田千代子
「どう活かす他人のデータ ―バイオインフォマティクス活用法―」
生物工学会誌, 91(9), 520-525 (2013)
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研究課題

SecMおよびTnaCの翻訳アレスト機構の1分子計測による解明

研究代表者

船津 高志(東京大学大学院薬学系研究科生体分析化学教室)
研究室HP

研究概要

 翻訳の制御は、生命活動の根幹に関わる重要なプロセスである。最近、新たな遺伝子発現制御機構として、「翻訳アレスト」と呼ばれる現象に関心が寄せられている。前回の公募研究課題では、SecM 翻訳アレスト複合体の安定性に関して精査し、新生ポリペプチド鎖のリボソーム外領域が翻訳アレストの安定性に大きく影響する結果を得た。これは、翻訳アレストにはC 末端にあるアレスト配列が必要十分であるという通説に再考を迫る結果である。
本研究では、この研究成果をさらに発展させ、SecM およびTnaC における翻訳アレストの維持・解除機構を明らかにすることを目的とし、以下の研究課題に取り組む。
(1) SecM 翻訳アレスト解除の1 分子力学測定
1分子のSecM 翻訳アレスト複合体に、光ピンセットを用いて様々な大きさの外力を複数の方向から印加し、その翻訳が再開する様子を直接観察する。これにより、翻訳アレスト解除の分子機構を明らかにする(図1)。
(2) TnaC 翻訳アレスト分子機構の1分子イメージングによる解明
RF2 がTnaC 翻訳アレスト複合体にどのようなタイミングで結合するかを、ナノ開口を用いて1 分子蛍光イメージングする。また、蛍光相互相関分光法(FCCS)をもちいてTnaC 翻訳アレスト複合体とRF2 の結合の有無を検討する。これにより、TnaC の翻訳はRF2 の結合が阻害されることによって起こるのか、RF2 は結合できるがリボソームの構造変化が抑制されることによって起こるのかを明らかにする。

図1 光ピンセットによるSeM翻訳アレスト解除

代表的な論文

1. Nakamura K, *Iizuka R, Nishi S, Yoshida T, Hatada Y, Takaki Y, Iguchi A, Yoon D. H, Sekiguchi T, Shoji S, *Funatsu T.
Culture-independent method for identification of microbial enzyme-encoding genes by activity-based single-cell sequencing using a water-in-oil microdroplet platform.
Sci. Rep., 6, 22259 (2016)
2. Yang Z, Iizuka R, *Funatsu T.
Nascent secM chain outside the ribosome reinforces translation arrest.
PLoS ONE, 10(3), e0122017 (2015)
3. Uno S, *Kamiya M, Yoshihara T, Sugawara K, Okabe K, Tarhan M. C, Fujita H, Funatsu T, Okada Y, Tobita S, *Urano Y.
A spontaneously blinking fluorophore based on intramolecular spirocyclization for live-cell super-resolution imaging.
Nat. Chem., 6, 681-689. (2014)
4. Takei Y, Iizuka R, Ueno T, *Funatsu T.
Single-molecule observation of protein folding in symmetric GroEL−(GroES)2 complexes.
J. Biol. Chem., 287 (49), 41118-41125. (2012)
5. Masuda T, Petrov A. N, Iizuka R, Funatsu T, *Puglisi J. D, *U. Sotaro.
Initiation factor 2 and 50S cooperate to lock mRNAs on the ribosome during initiation.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109 (13), 4881-4885. (2012)
6. Okabe K, Inada N, Gota C, Harada Y, Funatsu T, *Uchiyama S.
Intracellular temperature mapping with a fluorescent polymeric thermometer and fluorescence lifetime imaging microscopy.
Nat. Commun., 3, 705 (2012)
7. Iizuka R, Yamagishi-Shirasaki M, *Funatsu T.
Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins.
Anal. Biochem., 414, 173-178. (2011)
8. Okabe K, Harada Y, Zhang J, Tadakuma H, Tani T, *Funatsu T.
Real time monitoring of endogenous cytoplasmic mRNA using linear antisense 2’ O-methyl RNA probes in living cells.
Nucleic Acids Res., 34, e20 (2011)
9. Sameshima T, Iizuka R, Ueno T, Wada J, Aoki M, Shimamoto N, Ohdomari I, Tanii T, *Funatsu T.
Single-molecule study on the decay process of the football-shaped GroEL-GroES complex using zero-mode waveguides.
J. Biol. Chem., 285, 23159-23164. (2010)
10. *Kamei Y, Suzuki M, Watanabe K, Fujimori K, Kawasaki T, Deguchi T, Yoneda Y, Todo T, Takagi S, Funatsu T, *Yuba S.
Infrared laser-mediated gene induction in targeted single cells in vivo.
Nat. Methods, 6, 79-81. (2009)
11. Sameshima T, Ueno T, Iizuka R, Ishii N, Terada N, Okabe K, *Funatsu T.
Football-and bullet-shaped GroEL-GroES complexes coexist during the reaction cycle.
J. Biol. Chem., 283, 23765-23773. (2008)
12. Ueno T, Taguchi H, Tadakuma H, *Yoshida M, *Funatsu T.
GroEL mediates protein folding with a two successive timer mechanism.
Molecular Cell, 14, 423-434. (2004)
13. Fujiwara I, Takahashi S, Tadakuma H, Funatsu T, *Ishiwata S.
Microscopicanalysis of polymerization dynamics with individual actin filaments.
Nat. Cell Biol., 4, 666-673. (2002)
14. Taguchi H, Ueno T, Tadakuma H, *Yoshida M, Funatsu T.
Single-molecule observation of protein-protein interactions in the chaperonin system.
Nat. Biotechnol., 19, 861-865. (2001)
15. Ishijima A, Kojima H, Funatsu T, Tokunaga M, Higuchi H, Tanaka H, *Yanagida T.
Simultaneous observation of individual ATPase and mechanical events by a single myosin molecule during interaction with actin.
Cell, 92, 161-171. (1998)
16. *Vale R. D, Funatsu T, Pierce D. W, Romberg L, Harada Y, Yanagida T.
Direct observation of single kinesin molecules moving along microtubules.
Nature, 380, 451-453. (1996)
17. Funatsu T, Harada Y, Tokunaga M, Saito K, *Yanagida T.
Imaging of single fluorescent molecules and individual ATP turnovers by single myosin molecules in aqueous solution.
Nature, 374, 555-559. (1995)

総説

船津高志
1分子イメージング法によるタンパク質の機能と相互作用の解析
パリティ 23 (9), 19-23. (2008)
船津高志

細胞内mRNAの選択的蛍光標識とイメージングによる細胞機能解析
Drug Delivery System, 31(2), 110-118. (2016)


*Iizuka R, *Funatsu T.
Chaperonin GroEL uses asymmetric and symmetric reaction cycles in response to the concentration of non-native substrate proteins.
Biophys. Physicobiol., 13, 63-69. (2016)

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研究課題

神経の発生と疾患における新生鎖の生成機構と機能

研究代表者

池内 与志穂(東京大学・生産技術研究所)
研究室HP
鵜澤 尊規(理化学研究所・伊藤ナノ医工学研究室 専任研究員)

研究概要

神経細胞は、精密にタンパク質合成を制御することによって適切な形を形成し、正しく回路に組み込まれて働くことができる。この過程は脳の正常な働きに重要であり、タンパク質合成の制御異常は自閉症や知的障害などの脳の疾患を引き起こすことが知られている。近年、タンパク質合成の過程で生まれて間もない新生鎖タンパク質がリボソームや様々な因子と相互作用して機能を発揮する様子が明らかになってきたが、神経細胞の発生および形態形成における新生鎖タンパク質の実態と機能は十分に理解されていなかった。そこで、神経系細胞においてタンパク質を合成している途中でリボソームがmRNA上の特定の位置で停滞する現象(ストーリング)が起こる位置をリボソームプロファイリング法によって網羅的に同定した。この結果、これまでにリボソームと相互作用して機能を発揮している新生鎖タンパク質領域の候補を見出すことができた。今後は候補新生鎖タンパク質領域が神経細胞においてリボソームと相互作用してタンパク質合成を制御する機構を明らかにし、さらにその神経細胞の形態形成における役割を解明することで、神経における新生鎖タンパク質の役割を理解したい。特に、神経発生と脳の疾患に関連したmRNAにおけるストーリングに注目し、神経発生における新生鎖タンパク質の生成機構と機能を理解することによって、脳の疾患を克服することを目指して研究を行っている。

代表的な論文

1. Umegaki Y, Brotons AM, Nakanishi Y, Luo Z, Zhang H, Bonni A, Ikeuchi Y.
Palladin Is a Neuron-Specific Translational Target of mTOR Signaling That Regulates Axon Morphogenesis.
Journal of Neuroscience. 2018 May 23;38(21):4985-4995. doi: 10.1523/JNEUROSCI.2370-17.2018.
2. Kawada J, Kaneda S, Kirihara T, Maroof A, Levi T, Eggan K, Fujii T, Ikeuchi Y.
Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.
Stem Cell Reports. 2017 Nov 14;9(5):1441-1449. doi: 10.1016/j.stemcr.
2017.09.021.
報道:
朝日新聞(2017/10/27、朝刊)
化学工業日報(2017/10/27、朝刊)
日本経済新聞(2017/10/27、夕刊)
毎日新聞(2017/10/28、夕刊)
読売新聞(2017/11/1、夕刊)
科学新聞(2017/11/3、1面)
3. Huang J, Ikeuchi Y, Malumbres M, Bonni A.
A Cdh1-APC/FMRP Ubiquitin Signaling Link Drives mGluR-Dependent Synaptic Plasticity in the Mammalian Brain.
Neuron, 86, 726-39 (2015)
4.
  1. Ikeuchi Y, Dadakhujaev S, Chandhoke AS, Huynh MA, Oldenborg A, Ikeuchi M, Deng L, Bennett EJ, Harper JW, Bonni A, Bonni S.
    TIF1γ protein regulates epithelial-mesenchymal transition by operating as a small ubiquitin-like modifier (SUMO) E3 ligase for the transcriptional regulator SnoN1.
    J Biol Chem, 289, 25067-78. (2014)
5.
  1. Ikeuchi Y, de la Torre-Ubieta L, Matsuda T, Steen H, Okazawa H, Bonni A.
    The XLID Protein PQBP1 and the GTPase Dynamin 2 Define a Signaling Link that Orchestrates Ciliary Morphogenesis in Postmitotic Neurons.
    Cell Reports, 4, 879-89, (2013)
6.
  1. Mejia LA, Litterman N, Ikeuchi Y, de la Torre-Ubieta L, Bennett EJ, Zhang C, Harper JW, Bonni A.
    A Novel Hap1-Tsc1 Interaction Regulates Neuronal mTORC1 Signaling and Morphogenesis in the Brain
    Journal of Neuroscience, 33, 18015-21, (2013)
7.
  1. Huynh MA, Ikeuchi Y, Netherton S, de la Torre-Ubieta L, Kanadia R, Stegmüller J, Cepko C, Bonni S, Bonni A.
    An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain
    Neuron, 69, 930-44, (2011)
8.
  1. Litterman N, Ikeuchi Y, Gallardo G, O'Connell BC, Sowa ME, Gygi SP, Harper JW, Bonni A.
    An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning.
    PLoS Biology, 9, e1001060, (2011)
9.
  1. Ikeuchi Y, Kimura S, Numata T, Nakamura D, Yokogawa T, Ogata T, Wada T, Suzuki T, Suzuki T.
    Agmatine-conjugated cytidine in a tRNA anticodon is essential for AUA decoding in archaea.
    Nature Chemical Biology, 6, 277-82, (2010)
10.
  1. Ikeuchi Y, Stegmüller J, Netherton S, Huynh MA, Masu M, Frank D, Bonni S, Bonni A.
    A SnoN-Ccd1 Pathway Promotes Axonal Morphogenesis in the Mammalian Brain.
    Journal of Neuroscience, 29, 4312-21, (2009)
11.
  1. Ikeuchi Y, Kitahara K, Suzuki T.
    The RNA acetyltransferase driven by ATP hydrolysis synthesizes N4-acetylcytidine of tRNA anticodon.
    EMBO Journal, 27, 2194-203, (2008)
12.
  1. Ikeuchi Y, Shigi N, Kato J, Nishimura A, Suzuki T.
    Mechanistic insights into sulfur-relay by multiple sulfur mediators inved in thiouridine biosynthesis at tRNA wobble positions.
    Molecular Cell, 21, 97-108, (2006)
13.
  1. Numata T, Ikeuchi Y, Fukai S, Suzuki T, Nureki O.
    Snapshots of tRNA sulphuration via an adenylated intermediate.
    Nature, 442, 419-24, (2006)
14.
  1. Ikeuchi Y#, Soma A#, Ote T, Kato J, Sekine Y, Suzuki T. [# equally contributed]
    Molecular mechanism of lysidine synthesis that determines tRNA identity and codon recognition.
    Molecular Cell, 19, 235-46, (2005)
15.
  1. Soma A#, Ikeuchi Y#, Kanemasa S, Kobayashi K, Ogasawara N, Ote T, Kato J, Watanabe K, Sekine Y, Suzuki T.
    An RNA-modifying enzyme that governs both the codon and amino acid specificities of isoleucine tRNA.
    Molecular Cell, 12, 689-98, (2003)

総説

Angela Chow, Yoshiho Ikeuchi
“New approaches to understand dynamics of protein synthesis in neurons”
生産研究 69, 31-37 (2017)
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研究課題

新生鎖合成中のリボソームによるmRNA安定性制御機構の解明

研究代表者

三嶋 雄一郎(京都産業大学 総合生命科学部 准教授)
研究室HP

研究概要

リボソームによるmRNAの翻訳は、遺伝暗号であるコドンの配列からタンパク質を合成するセントラルドグマの中核を成す反応である。各コドンを解読する際のリボソームの挙動は一様ではなく、コドンに対応するtRNAの量やコドン-アンチコドン対合の様式、合成中の新生鎖の影響によって大きく変化することが知られている。我々は、ゼブラフィッシュをモデルとして用いた研究から、受精直後のmRNA安定性がORFのコドン組成によって規定されていることを見出した (Mishima et al., Mol Cell. 2016)。この発見は、新生鎖合成中のリボソームにはコドンの違いを「感知」してmRNAの安定性を調節する未知機能が備わっていることを示唆している。しかしリボソームによる特定のコドンの翻訳がどのようにしてmRNAの安定性の変化につながるのか、その分子メカニズムは現在のところほとんど明らかになっていない。本研究では、ゼブラフィッシュ初期胚を用いた実験系において培ってきた我々独自の知見とアプローチを生かし、リボソームによるコドン認識依存的なmRNA分解機構の分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。
(i) コドンがmRNA安定性に及ぼす効果を純粋に検出できる系を確立し、mRNA分解を引き起こすコドン上でのリボソームの挙動を解明する。
(ii) コドン依存的mRNA分解の発生時期特異性に着目し、コドン依存的mRNA分解に関与するリボソーム結合因子やリボソーム修飾の同定を行う。さらにその発生時期特異性をもたらす要因を解明し、コドン依存的mRNA分解機構の動作原理と個体発生過程における制御機構の理解を目指す。

代表的な論文

1. *Mishima Y and Tomari Y.
Codon usage and 3' UTR length determine maternal mRNA stability in zebrafish.
Molecular Cell, 61(6), 874-885.(2016)
2. Makino S, *Mishima Y, Inoue K, *Inada T.
Roles of mRNA-fate modulators Dhh1 and Pat1 in TNRC6-dependent gene silencing recapitulated in yeast.
The Journal of Biological Chemistry, 290(13), 8331-47. (2015)
3. Fukao A, Mishima Y, Takizawa N, Oka S, Imataka H, Pelletier J, Sonenberg N, Thoma C, *Fujiwara T.
microRNAs trigger dissociation of eIF4AI and II from target mRNAs in humans.
Molecular Cell, 56(1), 79-89. (2014)
4. Stahlhut C, Lu J, Suarez C, *Mishima Y, *Giraldez AJ.
miR-1 and miR-206 regulate angiogenesis by modulating VegfA expression.
Development,. 139(23), 4356-65. (2012)
5. *Mishima Y, Fukao A, Kishimoto T, Sakamoto H, Fujiwara T, *Inoue K.
Translational inhibition by deadenylation-independent mechanisms is central to microRNA-mediated silencing in zebrafish.
Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A,109 (4),  1104-9. (2012)
6. Cifuentes D, Xue H, Taylor D.W, Patnode H, Mishima Y, Cheloufi S, Ma E, Mane S, Hannon GJ, Lawson N, Wolfe S, *Giraldez AJ.
A novel miRNA processing pathway independent of Dicer requires Argonaute2 catalytic activity.
Science, 328(5986), 1694-8. (2010)
7. Mishima Y, Abreu-Goodger C, Staton AA, Stahlhut C, Shou C, Cheng C, Gerstein M, Enright AJ, *Giraldez AJ.
Zebrafish miR-1 and miR-133 shape muscle gene expression and regulate sarcomeric actin organization.
Genes & Development, 23(5), 619-32. (2009)
8. Mishima Y, Giraldez AJ, Takeda Y, Fujiwara T, Sakamoto H, *Schier A.F, *Inoue K.
Differential regulation of germline mRNAs in soma and germ cells by zebrafish miR-430.
Current Biology, 16(21), 2135-42. (2006) Selected in Faculty of 1000.
9. *Giraldez AJ, Mishima Y, Rihel J, Grocock RJ, Van Dongen S, Inoue K, Enright A.J, *Schier AF.
Zebrafish miR-430 promotes deadenylation and clearance of maternal mRNAs.
Science, 312(5770), 75-9. (2006)
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研究課題

新生鎖分解のUnstructured領域を介した多層的制御機構

研究代表者

伊野部 智由(富山大学 大学院理工学研究部(工学)准教授)
研究室HP

研究概要

リボソーム上の新生ポリペプチド鎖(新生鎖)は、作られている最中に分解を運命づけられることがある。一般的な新生鎖でも、構造を形成していないUnstructured領域を多く含み、細胞内で分解の脅威にさらされている。
翻訳に何らかのエラーがあり翻訳伸長反応が止まってしまった異常新生鎖には、E3ユビキチンリガーゼであるListerin(酵母ではLtn1)によりリボソーム上でポリユビキチン鎖が付加され、プロテアソームによる分解が試みられる。分解が誘導されない場合でも、Rqc2が異常新生鎖にCAT-tailとよばれるUnstructured領域も取り付け、異常新生鎖はリボソームから追い出される。CAT-tailは、分子シャペロンとの相互作用や、凝集体形成誘導効果を持つと報告されており、異常新生鎖の運命決定機構への関与が注目されている。 
申請者らはこれまで、プロテアソームによる効率的な蛋白質分解には、ポリユビキチン化だけでは不十分で、基質蛋白質自身にUnstructured領域が必要であることを明らかにしている。さらにこのようなUnstructured領域が蛋白質の分解制御に関わっていると提唱し、多くの人工的分解制御技術を報告している。
このような背景から、申請者は、新生鎖の運命決定にもUnstructured領域が関与していると考え、(1)プロテアソームによる異常新生鎖分解に対するCAT-tail などのUnstructured領域の影響を調べる必要があると考えた、さらに分子シャペロンとUnstructured領域の相互作用や、凝集体の形成も、新生鎖の分解制御と関わっているのではないかと考え、(2)Unstructured領域結合分子シャペロンによるプロテアソームの新生鎖分解制御機構の解明を目指す。以上の研究により、新生鎖の分解は、今まで考えられていた以上に多層的に制御されていることを示すことができるであろう。さらにこれらの研究成果をもとにして、(3)蓄積した異常新生鎖のアダプター蛋白質による分解誘導方法の開発を行い、神経変性疾患の治療にも一石を投じる。

代表的な論文

1. Yu, H., Singh Gautam AK., Wilmington, S., Wylie, D., Martinez-Fonts, K., Kago, G., Warburton, M., Chavali, S., Inobe, T., Finkelstein, I., Babu, MM., and Matouschek, A.
Conserved sequence preferences contribute to substrate recognition by the proteasome.
J. Biol. Chem, 291, 14526-39 (2016)
2. Kurosawa, N., Wakata, Y., Inobe, T., Kitamura, H., Yoshioka, M., Matsuzawa, S., Kishi, Y., and Isobe, M.
Novel method for the high-throughput production of phosphorylation site-specific monoclonal antibodies.
Sci. Rep, 6, 25174 (2016)
3. *Inobe, T. and Nozaki, M.
Proteasomal degradation of damaged polyubiquitin.
Biochem. Biophys. Res. Commun, 471, 34-40 (2016)
4. *Inobe, T. and Nukina, N.
Rapamycin-induced oligomer formation system of FRB-FKBP fusion proteins.
J. Biosci. Bioeng, 122, 40-46 (2016)
5. *Inobe, T. and Genmei, R.
Inhibition of the 26S proteasome by peptide mimics of the coiled-coil region of its ATPase subunits.
Biochem. Biophys. Res. Commun, 468, 143-150 (2015)
6. *Inobe, T., Nozaki, M. and Nukina, N.
Artificial regulation of p53 function by modulating its assembly.
Biochem. Biophys. Res. Commun, 467, 322-327 (2015)
7. Takahashi, K., Matouschek, A. and *Inobe, T.
Regulation of proteasomal degradation modulating an unstructured proteasomal initiation region of a substrate.
ACS Chem. Biol, 10, 2537–2543 (2015)
8. *Inobe, T. and Genmei, R.
N-terminal coiled-coil structure of ATPase subunits of 26S proteasome is crucial for proteasome function.
PLoS ONE 10, e0134056 (2015)
9. Fishbain, S., Inobe, T., Israeli, E., Chavali, S., Yu, H., Zokarkar, A., Babu, MM., and Matouschek, A.
The sequence composition of disordered regions affects protein half-life by controlling the initiation step of proteasomal degradation.
Nature Struct. Mol. Biol, 22, 214-221 (2015)
10.
  1. Inobe, T., Fishbain, S., Prakash, S. and Matouschek, A.

Defining the Geometry of the Two-component Proteasome Degron.
Nature Chem. Biol, 7, 161-167 (2011)

11.
  1. Prakash, S., Inobe, T., Hatch, A. J. and Matouschek, A.

Substrate Selection by the Proteasome during Degradation of Protein Complexes.
Nature Chem. Biol, 5, 29-36 (2009)

12.
  1. Inobe, T., Takahashi, K., Maki, K., Enoki, S., Kamagata, K., Kadooka, A., Arai, M. and Kuwajima, K.

Asymmetry of the GroEL-GroES Complex under Physiological Conditions as Revealed by Small-angle X-ray Scattering.

Biophys. J, 94, 1392-1402 (2008)
13.
  1. Inobe, T. and Kuwajima, K.

Φ value analysis of an allosteric transition of GroEL based on a single pathway model.
J. Mol. Biol, 339, 199-205 (2004)

総説

  1. Inobe, T. and Matouschek A.

Paradigms of protein degradation by the proteasome.
Curr. Opin. Struct. Biol, 24, 156-164 (2014)


  1. 高橋一暢、*伊野部智由

Unstructured領域を介したプロテアソームのタンパク質分解
生化学, 85, 1020-1024 (2013)


  1. Inobe, T. and Matouschek, A.

Protein targeting to ATP-dependent proteases.
Curr. Opin. Struct. Biol, 18, 43-51 (2008)


  1. Inobe, T., Kraut D. A. and Matouschek, A.

How to pick a protein and pull at it (News and views).
Nature Struct. Mol. Biol, 15, 1135-1136 (2008)

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研究課題

新生鎖VemPの翻訳伸長停止/解除機構の解明

研究代表者

森 博幸(京都大学 ウイルス・再生医科学研究所)
研究室HP

研究概要

細菌の効率的なタンパク質膜透過は、SecYEG 膜透過チャネルを挟んで存在する2つのモーター因子SecA ATPase とSecDF の協調的な働きにより進行する。我々は、「Vibrio族細菌が2種類のSecDFパラログを保持しており、高Na+環境下ではNa+駆動型のSecDF1のみを利用するが、低Na+条件下ではプロトン駆動型のSecDF2を特異的に発現誘導し膜透過能を維持する機構を持つ」事を見出した。VemP (Vibrio protein export monitoring polypeptide)は、159アミノ酸残基からなる分泌タンパク質であり、菌の膜透過活性をモニターする役割を持つ。膜透過能が低下した際には、自身の翻訳伸長をC末端近傍で安定に停止し、同一オペロン下流に位置するsecDF2の発現量を増加させる。この翻訳伸長の停止は、膜透過が正常な時は一過的であり速やかに解除される。翻訳停止を介した下流遺伝子の発現制御機構は、大腸菌secM-secAにおいて最初に見出され詳しく研究がなされているが、VemP の予想翻訳停止配列(アレストモチーフ)は、SecM のそれと全く異なっている。本研究では、1)レポーターシステムを構築し、C末端保存領域の徹底的な変異解析を通してVemP翻訳アレストモチーフを同定すると共に、VemP翻訳アレスト能が低下したリボソーム変異を分離し、VemP 翻訳停止機構の解明を目指す。2)in vitro タンパク質合成系とin vitro 膜透過実験系を組み合わせ、VemP の膜透過反応と共役した翻訳アレスト解除の実験系を構築する。この系を用いて、VemP arrest解除における ア)翻訳と膜透過の共役効果、イ) エネルギー要求性、ウ)トランスロコンとの相互作用の効果等を検討する。加えて、エ)翻訳アレスト解除に必要なVemP分子内のシス領域の同定も進め、翻訳停止解除のメカニズムの解明を目指す。

代表的な論文

1.
  1. Mori, H.*, Sakashita, S., Ito, J., Ishii, E. and Akiyama, Y.
    Identification and characterization of arrest motif in VemP by systematic mutational analysis.
    J. Biol. Chem. 293, 2915-2926 (2018) doi:10.1074/jbc.M117.816561

2.
  1. Miyazaki, R., Myogo, N., Mori, H. and Akiyama, Y.*
    A new photo-cross-linking approach for analysis of protein dynamics in vivo.
    J. Biol. Chem. 293, 677-686 (2018). doi:10.1074/jbc.M117.817270

3.
  1. Daimon, Y., Masui, C., Tanaka, Y., Shiota, T., Suzuki, T., Miyazaki, R., Sakurada, H., Lithgow, T., Dohmae, N., Mori, H., Tsukazaki, T.*, Narita, S.* and Akiyama, Y*.
    BepA mediates productive transfer of substrate proteins to the b-barrel assembly machinery (BAM) complex.
    Mol. Microbiol. 106, 760-776 (2017) doi: 10.1111/mmi.13844

4.
  1. Furukawa, A., Yoshikaie, K., Mori, T., Mori, H., Morimoto, Y. V., Sugano, Y., Iwaki, S., Minamino, T., Sugita, Y., Tanaka, Y. and Tsukazaki, T.*
    Tunnel Formation Inferred from the I-Form Structures of the Proton-Driven Protein Secretion Motor SecDF
    Cell Reports 19, 895-901. (2017)

5.
  1. Miyazaki, R., Yura, T., Suzuki, T. Dohmae, N., Mori, H. and Akiyama, Y.*
    A novel SRP recognition sequence in the homeostatic control region of heat shock transcription factor sigma 32
    Sci. Rep. 6, 24147 (2016) doi:10.1038/srep24147.

6.
  1.  Ishii, E., Chiba, S., Hashimoto, N., Kojima, S., Homma, M., Ito, K., Akiyama, Y. and Mori, H.*
    Nascent chain-monitored remodeling of the Sec machinery for salinity adaptation of marine bacteria

    Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112,E5513-E5522. (2015) doi:10.1073/pnas.1513001112
7.
  1. Akiyama, K., Mizuno, S., Hizukuri, Y., Mori, H., Nogi, T. and Akiyama, Y.* Roles of the membrane-reentrant β-hairpin-like loop of RseP protease in selective substrate cleavage
    eLife, 4, e08928. (2015)

8.
  1. Kumazaki, K., Kishimoto, T., Furukawa, A., Mori, H., Tanaka, Y., Dohmae, N., Ishitani, R., Tsukazaki, T.*, and Nureki, O.*
    (2014) Crystal structure of Escherichia coli YidC, a membrane protein chaperone and insertase.
    Sci. Rep. 4, 7299 (2014) doi: 10.1038/srep07299

9.
  1.  Kumazaki, K., Chiba, S.# Takemoto, M., Furukawa, A., Nishiyama, K., Sugano Y., Mori, T., Dohmae, N., Hirata, K., Nakada-Nakura, Y., Maturana, A., Tanaka, Y., Mori, H., Sugita, Y., Arisaka, F., Ito, K., Ishitani, R., Tsukazaki, T.* and Nureki O.*
    Structural basis for Sec-independent membrane protein insertion by YidC.
    Nature 509, 516-519. (2014)

10.
  1. Mio, K., Tsukazaki, T., Mori, H., Kawata, M., Moriya, T., Sasaki, Y., Ishitani, R., Ito, K., Nureki, O.* and Sato, C.*
    Conformational variation of the translocon enhancing chaperone SecDF.
    J. Struct. Funct. Genomics. 15, 107-115. (2014)

11.
  1. Saito, A., Hizukuri, Y., Matsuo, E.-i., Chiba, S., Mori, H., Nishimura, O., Ito, K., and Akiyama, Y.
    Post liberation cleavage of signal peptides is catalyzed by the S2P protease in bacteria.
    Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108, 13740–13745. (2011)

12.
  1. Tsukazaki, T.#, Mori, H. #, Echizen, Y., Ishitani, R., Fukai, S., Tanaka, T., Perederina, A., Vassylyev, D. G., Kohno, T., Matsurana, A. D., Ito, K.* and Nureki O.*
    (2011) Structure and function of a membrane component SecDF that enhances protein export.
    Nature 474, 235-238. (2011) #These authors contributed equally to this work.

13.
  1. Tsukazaki, T. #, Mori, H. #, Fukai, S., Ishitani, R., Mori, T., Dohmae, N., Perederina, A., Sugita, Y., Vassylyev, D. G., Ito, K.* and Nureki O.*
    Conformational transition of Sec machinery inferred from bacterial SecYE structures.
    Nature 455, 988-991. (2008) #These authors contributed equally to this work.

14.
  1. Vassylyev, D. G.*, Mori, H., Vassylyeva, M. N., Tsukazaki, T., Kimura Y., Tahirov, H. T. & Ito K.
    Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals, a parallel, head-to-head dimer.
    J. Mol. Biol. 364, 248-258. (2006)

15.
  1. Mori H. & Ito, K. *
    The long alpha-helix of SecA is important for mechanoconversion of its ATPase engine.
    J. Biol.Chem. 281, 36249-36256. (2006)

16.
  1. Mori, H. & Ito, K. *
    Different modes of SecY-SecA interactions revealed by site-directed in vivo photo-cross-linking.
    Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 16159-16164. (2006)

17.
  1. Nakatogawa, H., Murakami, A., Mori, H. & Ito, K. *
    SecM facilitates translocase function of SecA by localizing its biosynthesis.
    Genes & Dev. 19, 436-444. (2005)

18.
  1. Mori, H., Shimokawa, N., Satoh, Y. & Ito, K. *
    Mutational analysis of transmembrane regions 3 and 4 of SecY, a central component of protein translocase.
    J. Bacteriol. 186, 3960-3969. (2004)

19.
  1. Mori, H., Tsukazaki, T., Masui, R., Kuramitsu, S., Yokoyama, S., Johnson, A. E., Kimura, Y., Akiyama, Y. & Ito, K. *
    Fluorescence resonance energy transfer analysis of protein translocase: SecYE from Thermus thermophilus HB8 forms a constitutive oligomer in membrane.
    J. Biol. Chem. 278, 14257-14264. (2003)

20.
  1. Mori, H. & Ito, K. *
    Biochemical characterization of a mutationally altered protein translocase: Protein motive force stimulation of the initiation phase of translocation.
    J. Bacteriol. 185, 405-412. (2003)

21.
  1. Mori, H., Akiyama, Y. & Ito, K. *
    A SecE mutation that modulates SecY-SecE translocase assembly, identified as a specific suppressor of SecY defects.
    J. Bacteriol. 185, 948-956. (2003)

22.
  1. Mori, H. Shimizu, Y. & Ito, K. *
    (2002) Super active SecY variants that fulfill the essential translocation function with a reduced cellular quantity.
    J. Biol. Chem. 277, 48550-48557. (2002)

23.
  1. Mori, H. & Ito, K. *
    An essential amino acid residue in the protein translocation channel revealed by targeted random mutagenesis of SecY.
    Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 5128-5133. (2001)

総説

  1. 石井英治*、森 博幸

「ビブリオ属細菌における2つのタンパク質膜透過促進因子の生理的意義と使い分け機構」
医学の歩み, 261, 1178-1179 (2017)


  1. 森 博幸*、塚崎智也

「細菌のタンパク質分泌を促進する膜タンパク質SecDFの構造と機能」
化学と生物, 51, 28-35. (2013)


  1. 森 博幸*、塚崎智也

「立体構造解析からみえてきたSecAによる蛋白質の膜透過の駆動機構」
蛋白質核酸酵素54, 685-695. (2009)


  1. Ito, K. * and Mori, H.

The Sec protein secretion system. (2009)
pp. 3-22, in Bacterial Secreted Proteins, Ed. K. Wooldridge, Caister Academic Press, Norfolk, UK


  1. Mori, H. & Ito, K. *

The Sec protein-translocation pathway.
Trends Microbiol. 9, 494-499. (2001)

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研究課題

タンパク質新生鎖の末端プロテオーム解析

研究代表者

石濱 泰(京都大学大学院薬学研究科・教授)
研究室HP

研究概要

大腸菌プロテオーム完全解析を可能にした独自のnanoLC-MS/MSシステムに、新規末端ペプチド濃縮法であるcharge-assisted terminal peptide enrichment (CHAT)法を新規に開発し、末端プロテオーム解析プラットフォームを確立する。新生鎖プロテオーム抽出のための安定同位体パルス標識法とこれらの方法を組み合わせることにより、タンパク質新生鎖の末端プロテオーム解析が可能となる。
N, C末端由来のペプチドを濃縮する従来の方法は、煩雑な化学修飾マルチステップを経るものであり、大規模解析への展開は困難であったが、今回新たに開発するN, C末端ペプチド同時濃縮法であるCHAT法は、イオン交換クロマトグラフィーのみで構成される。すでにヒト由来培養細胞を用いた予備検討の結果、1000タンパク質を超えるN, C末端ペプチドの同定に成功しており、本手法とパルス標識法を組み合わせることにより、新生鎖末端プロテオーム解析を行う。バクテリアですでに発見しているN末端アシル化とリン酸化の生理的意義を含めて、新生鎖における末端修飾を非新生鎖と比較することにより、翻訳中修飾の網羅的な解析も行う。修飾も含めたタンパク質新生鎖の末端プロテオームプロファイルを様々な生物について取得するので、これらを領域全体の基盤情報として提供し、RNA側からの情報と照合することにより、新たな知見の取得が期待できる。オミクスによる俯瞰と従来の個別分子解析は、相補的であり相乗効果も期待でき、新生鎖産生の新規制御機構解明につながる可能性もある。

代表的な論文

1.
  1. Imamura H, Wagih O, Niinae T, Sugiyama N, Beltrao P, *Ishihama Y.

Identifications of Putative PKA Substrates with Quantitative Phosphoproteomics and Primary-Sequence-Based Scoring.
J Proteome Res, 16(4), 1825-1830. (2017)

2.
  1. *Okuda S, Watanabe Y, Moriya Y, Kawano S, Yamamoto T, Matsumoto M, Takami T, Kobayashi D, Araki N, Yoshizawa A. C, Tabata T, Sugiyama N, Goto S, *Ishihama Y.

jPOSTrepo: an international standard data repository for proteomes.
Nucleic Acids Res, 45(D1), D1107-D1111. (2017)

3.
  1. *Nakahigashi K, Takai Y, Kimura M, Abe N, Nakayashiki T, Shiwa Y, Yoshikawa H, Wanner B. L, Ishihama Y, Mori H.

Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling.
DNA Res, 23(3), 193-201. (2016)

4.
  1. Miki T, Awa M, Nishikawa Y, Kiyonaka S, Wakabayashi M, Ishihama Y, *Hamachi I.

A conditional proteomics approach to identify proteins involved in zinc homeostasis.
Nat Methods, 13(11), 931-937. (2016)

5.
  1. Wakabayashi M, Kyono Y, Sugiyama N, *Ishihama Y.

Extended Coverage of Singly and Multiply Phosphorylated Peptides from a Single Titanium Dioxide Microcolumn.
Anal Chem, 87(20), 10213-21. (2015)

6.
  1. Tsai C. F, Wang Y. T, Yen H. Y, Tsou C. C, Ku W. C, Lin P. Y, Chen H. Y, Nesvizhskii A. I, *Ishihama Y, *Chen Y. J.

Large-scale determination of absolute phosphorylation stoichiometries in human cells by motif-targeting quantitative proteomics.
Nat Commun, 6, 6622. (2015)

7.
  1. Shinoda K, Ohyama K, Hasegawa Y, Chang H. Y, Ogura M, Sato A, Hong H, Hosono T, Sharp L. Z, Scheel D. W, Graham M, Ishihama Y, *Kajimura S.

Phosphoproteomics Identifies CK2 as a Negative Regulator of Beige Adipocyte Thermogenesis and Energy Expenditure.
Cell Metab, 22(6), 997-1008. (2015)

8.
  1. Lin M. H, Sugiyama N, *Ishihama Y.

Systematic profiling of the bacterial phosphoproteome reveals bacterium-specific features of phosphorylation.
Sci Signal, 8(394), rs10. (2015)

9.
  1. Wakabayashi M, Yoshihara H, Masuda T, Tsukahara M, Sugiyama N, *Ishihama Y.

Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.
J Proteome Res, 13(2), 915-24. (2014)

10.
  1. Imamura H, Sugiyama N, Wakabayashi M, *Ishihama Y.

Large-scale identification of phosphorylation sites for profiling protein kinase selectivity.
J Proteome Res, 13(7), 3410-9. (2014)

11.
  1. Horie K, Kamakura T, Ikegami T, Wakabayashi M, Kato T, Tanaka N, *Ishihama Y.

Hydrophilic interaction chromatography using a meter-scale monolithic silica capillary column for proteomics LC-MS.
Anal Chem, 86(8), 3817-24. (2014)

12.
  1. Yamana R, Iwasaki M, Wakabayashi M, Nakagawa M, Yamanaka S, *Ishihama Y.

Rapid and Deep Profiling of Human Induced Pluripotent Stem Cell Proteome by One-shot NanoLC-MS/MS Analysis with Meter-scale Monolithic Silica Columns.
J Proteome Res, 12(1), 214-21. (2013)

13.
  1. Imami K, Sugiyama N, Imamura H, Wakabayashi M, Tomita M, Taniguchi M, Ueno T, Toi M, *Ishihama Y.

Temporal profiling of lapatinib-suppressed phosphorylation signals in EGFR/HER2 pathways.
Mol Cell Proteomics, 11(12), 1741-57. (2012)

14.
  1. Masuda T, Sugiyama N, Tomita M, *Ishihama Y.

Micro-scale phosphoproteome analysis of 10,000 cells from human cancer cell lines.
Anal Chem, 83(20), 7698-703. (2011)

15.
  1. Iwasaki M, Miwa S, Ikegami T, Tomita M, Tanaka N, *Ishihama Y.

One-Dimensional Capillary Liquid Chromatographic Separation Coupled with Tandem Mass Spectrometry Unveils the Escherichia coli Proteome on a Microarray Scale.
Anal Chem, 82(7), 2616-20. (2010)

16.
  1. Fujiwara K, Ishihama Y, Nakahigashi K, Soga T, *Taguchi H.

A systematic survey of in vivo obligate chaperonin-dependent substrates.
EMBO J, 29(9), 1552-64. (2010)

17.
  1. Sugiyama N, Nakagami H, Mochida K, Daudi A, Tomita M, *Shirasu K, *Ishihama Y.

Large-scale phosphorylation mapping reveals the extent of tyrosine phosphorylation in Arabidopsis.
Mol Syst Biol, 4, 193. (2008)

18.
  1. #Kerner M. J, #Naylor D. J, #Ishihama Y, #Maier T, Chang H. C, Stines A. P, Georgopoulos C, Frishman D, Hayer-Hartl M, Mann M, *Hartl F. U.

Proteome-wide analysis of chaperonin-dependent protein folding in Escherichia coli.
Cell, 122(2), 209-20. (2005) (#shared first authors)

19.
  1. Ishihama Y, Sato T, Tabata T, Miyamoto N, Sagane K, Nagasu T, *Oda Y.

Quantitative mouse brain proteomics using culture-derived isotope tags as internal standards.
Nat Biotechnol, 23(5), 617-21. (2005)

20.
  1. Lasonder E, Ishihama Y, Andersen J. S, Vermunt A. M, Pain A, Sauerwein R. W, Eling W. M, Hall N, Waters A. P, Stunnenberg H. G, *Mann M.

Analysis of the Plasmodium falciparum proteome by high-accuracy mass spectrometry.
Nature, 419 (6906), 537-42. (2002)


総説

  1. Sugiyama N, *Ishihama Y.

Large-scale profiling of protein kinases for cellular signaling studies by mass spectrometry and other techniques.
J Pharm Biomed Anal, 130, 264-272. (2016)


  1. Iwasaki M, *Ishihama Y.

Challenges Facing Complete Human Proteome Analysis.
Chromatography, 35, 73-80. (2014)

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研究課題

サイトゾルで合成される葉緑体蛋白質新生鎖の二重包膜膜透過連携機構の解析

研究代表者

中井 正人(大阪大学・蛋白質研究所 准教授)
研究室HP

研究概要

細胞は数千から数万種類の蛋白質が新生鎖として合成され、機能すべき区画に正しく輸送配置されることで維持される。特に真核細胞では新生鎖の多くが様々な細胞内のオルガネラへと運ばれ特異的な代謝機能を担う。新生鎖のオルガネラへの輸送機構の解明は、真核細胞構築原理の理解に重要な課題である。植物や藻類の葉緑体は外包膜、内包膜の二重膜に囲まれ、新生鎖はこの包膜を通過して運ばれる。これまでの研究で、葉緑体蛋白質の新生鎖は、外包膜の1メガダルトンの蛋白質膜透過装置TOCと内包膜の1メガダルトンの膜透過装置TICを介して運ばれること、膜透過の駆動に2メガダルトンのATPaseモーター複合体が関与することを見出している。さらにTOC-TIC-モーターの3つの超分子複合体が二重の葉緑体包膜を介し物理的に相互作用して新生鎖の膜透過を担っている事を示唆するデータを得ている。そこで今年度から2年間の本公募研究では、特に、①外包膜と内包膜の二重の生体膜間をいかに効率よく二つの膜透過装置が連携して多様な葉緑体蛋白質を透過させているのかの作用機序の解明を目指す。これに関連して、最近、材料や条件を選べば、TOC-TICの複合体を比較的安定に精製することができることを見出した。そこで、この知見を利用して、②TOC-TIC 間の機能的連携の構造的基盤に迫る。さらには、単細胞藻類の実験系を利用することで、③in vivoにおいてリボソームで合成途上の新生鎖がTOC-TIC複合体と相互作用するタイミング、および、④リボソーム自身とTOCとの物理的・機能的連携についての解析も進めたい。

代表的な論文

1.
  1. *Nakai M.
Ycf1: A Green TIC.
Plant Cell., 27(7), 1834-1838. (2015)
2.
  1. Kikuchi S, Bedard J, Hirano M, Hirabayashi Y, Oishi M, Imai M, Takase M, Ide T, *Nakai M.
Uncovering the Protein Translocon at the Chloroplast Inner Envelope Membrane.
Science, 339, 571-574. (2013)
3.
  1. Hirabayashi Y, Kikuchi S, Oishi M, *Nakai M.
In vivo studies on the roles of two closely related Arabidopsis Tic20 proteins, Tic20-I and Tic20-IV.
Plant Cell Physiol., 52, 469-478. (2011)
4.
  1. Kikuchi S, Oishi M, Hirabayashi Y, Lee D.W, Hwang I, *Nakai M.
A 1-Megadalton Translocation Complex Containing Tic20 and Tic21 Mediates Chloroplast Protein Import at the Inner Envelope Membrane.
Plant Cell, 21(6),1781-1797. (2009)
5.
  1. Asakura Y, Kikuchi S, *Nakai M.
Non-identical contributions of two membrane-bound cpSRP components, cpFtsY and Alb3, to thylakoid biogenesis.
Plant J., 56,1007-1017. (2008)
6.
  1. Yabe T, Yamashita E, Kikuchi A, Morimoto K, Nakagawa A, Tsukihara T, *Nakai M.
Structural analysis of Arabidopsis CnfU protein: an iron-sulfur cluster biosynthetic scaffold in chloroplasts.
J. Mol. Biol., 381(1),160-73. (2008)
7.
  1. Morimoto K, Yamashita E, Kondou Y, Lee S. J, Arisaka F, Tsukihara T, *Nakai M.
The asymmetric IscA homodimer with an exposed [2Fe-2S] cluster suggests the structural basis of the Fe-S cluster biosynthetic scaffold.
J. Mol. Biol., 360(1),117-132. (2006)

総説

  1. *中井 正人
    特集:真核細胞の共生由来オルガネラ研究最前線ー広がり続ける多様性と機能.
    葉緑体のタンパク質輸送機構についてーシアノバクテリアの内共生から始まったユニークな進化
    生物の科学:遺伝 3月号(株式会社NTS)70(2), 105-109 (2016)


    *Nakai M.
    The TIC complex uncovered: The alternative view on the molecular mechanism of protein translocation across the inner envelope membrane of chloroplasts.
    Biochim. Biophys. Acta., 1847(9), 957-967. (2015)


    菊地 真吾、平野 美奈子、井出 徹、*中井 正人.
    明らかになった葉緑体のトランスロコン

    細胞工学8月号(学研メディカル秀潤社)HOT PRESS, 32(8), 882-883. (2013).

  2. Kikuchi S, Bedard J, *Nakai, M.
    One- and Two-Dimensional Blue Native-PAGE and Immunodetection of Low-Abundance Chloroplast Membrane Protein Complexes. Chloroplast Research in Arabidopsis: Methods and Protocols Vol.II (Jarvis, T.P., ed).

    Methods in Molecular Biology, 775, 3-17. (2011)
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研究課題

新生膜タンパク質の膜組込み過程の構造生物科学研究

研究代表者

田中 良樹(奈良先端科学技術大学院大学・バイオサイエンス研究科・助教)
研究室HP

研究概要

本研究は,生育に必須の「新生膜タンパク質の膜組込み過程」に注目する。タンパク質の膜組み込み過程はすべての生物に保存された基本的な細胞内機構の一つである。バクテリアにおける膜タンパク質の組込みには,主にSec 経路とYidC 経路が存在する(図1)。Sec 経路ではすべての生物に保存されたタンパク質膜透過チャネルSecYEG 膜タンパク質複合体(Sec トランスロコン)を経由し,YidC 経路では保存された5回膜貫通をもつ内膜タンパク質YidC(ミトコンドリアOxa1 ・葉緑体Alb3)を経由する。どちらの経路も生育に必須であるが,どちらの過程においても,どのようにタンパク質が認識され,膜へと組込まれているのかの詳細は不明である。

申請者らは膜タンパク質複合体SecYEGと膜タンパク質YidC の単独のX 線結晶構造解析を達成した。本研究では,これらの実験を発展させ,膜タンパク質組込み過程における新生ポリペプチド鎖とSecYEG またはYidC との相互作用機序を明らかとすべく,シグナルペプチド領域との共結晶化構造解析を進めると共に,in vítro における新しい膜組込み解析系を構築し解析を進める。

  1. 1.SecYEG-シグナル配列,YidC-シグナル配列の複合体構造解析:
    • ・残基レベルでの基質認識機構を解明
    • ・基質との相互作用による構造変化を解明
  2. 2.YidC再構成系による新しい機能解析法の構築と機能解析
  3. 3.膜組み込み過程の分子動力学シミュレーション
    ・膜組込み過程のin silico再現

 

代表的な論文

1.
  1. Furukawa A, Yoshikaie K, Mori T, Mori H, Morimoto YV, Sugano Y, Iwaki S, Minamino T, Sugita Y, Tanaka Y, Tsukazaki T.

Tunnel Formation Inferred from the I-Form Structures of the Proton-Driven Protein Secretion Motor SecDF.
Cell Rep., 2;19(5), 895-901. (2017)

2.
  1. Tanaka Y, Sugano Y, Takemoto M, Mori T, Furukawa A, Kusakizako T, Kumazaki K, Kashima A, Ishitani R, Sugita Y, *Nureki O and *Tsukazaki T.

Crystal structures of SecYEG in lipidic cubic phase elucidate a precise resting and a peptide-bound states.
Cell Rep., 13(8), 1561-8. (2015)

3.
  1. Kumazaki K, Kishimoto T, Furukawa A, Mori H, Tanaka Y, Dohmae N, Ishitani R, Tsukazaki T, Nureki O.

Crystal structure of Escherichia coli YidC, a membrane protein chaperone and insertase.
Sci Rep., 3;4:7299. (2014)

4.
  1. Kumazaki K, Tsukazaki T, Nishizawa T, Tanaka Y, Kato H.E, Nakada-Nakura Y, Hirata K, Mori Y, Suga H, Dohmae N, Ishitani R, Nureki O.

Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of YidC, a membrane-protein chaperone and insertase from Bacillus halodurans.
Acta Crystallogr F Struct Biol Commun., 70(Pt 8), 1056-60. (2014)

5.
  1. Kumazaki K, Chiba S, Takemoto M, Furukawa A, Nishiyama K, Sugano Y, Mori T, Dohmae N, Hirata K, Nakada-Nakura Y, Maturana A.D, Tanaka Y, Mori H, Sugita Y, Arisaka F, Ito K, Ishitani R, Tsukazaki T, Nureki O.

Structural basis of Sec-independent membrane protein insertion by YidC.
Nature, 22;509(7501), 516-20. (2014)

6.
  1. Sugahara M, Mizohata E, Nango E, Suzuki M, Tanaka T, Masuda T, Tanaka R, Shimamura T, Tanaka Y, Suno C, Ihara K, Pan D, Kakinouchi K, Sugiyama S, Murata M, Inoue T, Tono K, Song C, Park J, Kameshima T, Hatsui T, Joti Y, Yabashi M, Iwata S.

Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.
Nat Methods., 12(1), 61-3. (2015)

7.
  1. Tanaka Y, Hipolito C.J, Maturana A.D, Ito K, Kuroda T, Higuchi T, Katoh T, Kato H.E, Hattori M, Kumazaki K, Tsukazaki T, Ishitani R, Suga H and Nureki O.

“Structural basis for the drug extrusion mechanism by a MATE multidrug transporter.”
Nature, 496, 247–251. (2013)

8.
  1. Hipolito C.J, Tanaka Y, Katoh T, Nureki O, Suga H,

“A macrocyclic peptide that serves as a cocrystallization ligand and inhibits the function of a MATE family transporter.”
Molecules, 18(9), 10514-30. (2013)

9.
  1. Hattori M, Tanaka Y, Ishitani R and Nureki O.

"Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the cytosolic domain of a cation diffusion facilitator family protein."
Acta Cryst. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun., 63(Pt 9), 771-773. (2007)

10.
  1. Hattori M, Tanaka Y, Fukai S, Ishitani R and Nureki O.

"Crystal structure of the MgtE Mg2+ transporter."
Nature, 448, 1072-1075. (2007)

11.
  1. Hattori M, Tanaka Y, Fukai S, Ishitani R and Nureki O.

"Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the full-length Mg2+ transporter MgtE."

Acta Cryst. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun., 63(Pt 8), 682-684. (2007)
12.
  1. Tanaka Y, Hattori M, Fukai S, Ishitania R and Nureki O.

"Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the cytosolic domain of the Mg2+ transporter MgtE."
Acta Cryst. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun., 63(Pt 8), 678-681. (2007)

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研究課題

新生鎖分解による小胞体の予防的品質管理システムに関する研究

研究代表者

西頭 英起(宮崎大学医学部機能生化学)
研究室HP

研究概要

多くの新規合成タンパク質は翻訳後すぐに分解されることと、リボソームの多くが小胞体に結合していることを併せ考えると、翻訳時挿入に関わるリボソーム上での新生鎖分解機構を明らかにすることは、真核細胞のタンパク質品質管理の観点から極めて重要と考えられます。細胞は、ストレス時に小胞体ホメオスタシスの破綻を避けるために、本来小胞体に挿入されるべきシグナル配列を持つタンパク質の翻訳を細胞質内で完了し直接分解します(小胞体の予防的品質管理システム、ER stress-induced pre-emptive quality control:ERpQC)(図)。しかし、その分子メカニズムは不明でした。私たちはこれまでに、小胞体膜分子Derlinが、ストレス時に分泌タンパク質などを「小胞体を経由した分泌」から「細胞質での分解」へと運命を変化させること、さらにはAAA ATPaseであるp97ならびにコシャペロン分子Bag6がそれらの分解を担うことを明らかにしてきました(Cell Rep. 2015:図)。本研究では、ERpQCの更なる分子メカニズムを解明するとともに、その生理的意義について、特に中枢神経系組織を用いて検証することを目指します。解決すべき分子メカニズムとしては、「Derlinとともにリボソームから基質を選別する直接の因子は何か?」「ERpQC基質となる分泌タンパク質と、分解されない小胞体シャペロンでは何が異なるのか?」などの点が残されています。本研究期間に、ERpQCの「基質」「装置」「細胞内局在」「生理的意義」について研究を進めます。

代表的な論文

1.

Kadowaki, H., Satrimafitrah, P., Takami, Y. and Nishitoh H.
Molecular mechanism of ER stress-induced pre-emptive quality control involving association of the translocon, Derlin-1, and HRD1.
Sci. Rep. 8, 7317. (2018). doi:10.1038/s41598-018-25724-x.

2.

Murao, N. and Nishitoh H.
Role of the unfolded protein response in the development of central nervous system.
J. Biochem. 162,155-162. (2017). doi: 10.1093/jb/mvx047.

3.
  1. Kadowaki H, Nagai A, Maruyama T, Takami Y, Satrimafitrah P, Kato H, Honda A, Hatta T, Natsume T, Sato T, Kai H, Ichijo H, Nishitoh H.

Preemptive quality control protects the ER from protein overload via the proximity of ERAD components and SRP.
Cell Rep, 13, 944-956. (2015)

4.
  1. Nishitoh H, Kadowaki H, Nagai A, Maruyama T, Yokota T, Fukutomi H, Noguchi T, Matsuzawa A, Takeda K, Ichijo H.

ALS-linked mutant SOD1 induces ER stress- and ASK1-dependent motor neuron death by targeting Derlin-1.
Genes Dev, 22, 1451-1464. (2008)

総説

  1. Kato H, Nishitoh H.

Stress responses from the endoplasmic reticulum in cancer.
Front. Oncol. 5, 93 eCollection (2015)


  1. 西頭英起

小胞体におけるタンパク質の品質管理の分子機構および中枢神経系における小胞体ストレス応答の役割.

領域融合レビュー 4, e009 (2015)
http://leading.lifesciencedb.jp/4-e009/#more-1147
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研究課題

アミノ酸飢餓応答における停滞リボソーム-新生鎖複合体の解析

研究代表者

山下 暁朗(横浜市立大学 医学部)
研究室HP

研究概要

生物は栄養が不足した際に、消費を抑えて、飢餓による細胞死を防ぐ仕組みを持つ。こうした仕組みは出芽酵母からヒトを含む高等動物にまで共通であり、mTORC1 不活性化とGCN2 活性化により翻訳が抑制される。一方で、飢餓アミノ酸をコードするコドン上で停滞したリボソーム上の新生鎖の運命についてはほとんど解析が進んでいない。
そこで、本研究では、アミノ酸飢餓時に飢餓アミノ酸コドン上で停滞したリボソーム上の新生鎖を簡便に解析するレポーターを新たに作成し、mTORC1やGCN2などのシグナル経路と新生鎖の運命の関わりの解明を目指す。
アミノ酸飢餓により停滞したリボソーム上の新生鎖を簡便に解析するため、NanoLucを用いたレポーターを設計した。V5-tagged-NanoLucの下流に40アミノ酸以上のスペーサー配列(T4 Lysozyme)と飢餓アミノ酸コドン、自己開裂ペプチド(P2A)、HaloTagを配置する(図A)。このレポーターとribosome精製のためのeGFP-rpS10a融合タンパク質を安定発現する細胞株を樹立する。これを用いて、GFP抗体ビーズにより精製したリボソームと共精製されるNanoLuc新生鎖の活性を測定することで、新生鎖存在量を簡易に定量化する(図B, C)。このとき、リボソーム停滞がNanoLuc上で起きないようにするため、飢餓するアミノ酸をNanoLucから点変異により置換・除去する。基礎解析により、アルギニン、リジン、ロイシンのそれぞれ一種類の置換・除去については活性が2/3~1/1000に落ちるもののNanoLuc活性が検出されることを明らかにしている(未発表)。
これまでに、アミノ酸飢餓が誘導する停滞ribosomeに含まれる分子を同定しており、その結合タンパク質としてproteasome構成因子を複数同定している(大野茂男教授(横浜市立大学)、平野久教授(横浜市立大学)の協力)。そこで、レポーター細胞作成後、アミノ酸飢餓時に、新生鎖がどのような運命をたどるのかを、proteasome阻害剤の影響を解析することで明らかにする。アミノ酸飢餓は、培養液から1種類のアミノ酸を除くことで誘導する。さらに、「新生鎖のユビキチン化が誘導されるのか」、「ユビキチン化が誘導される場合それは新生鎖の安定性に影響を与えるのか」についてもリジン/ロイシン置換・除去したNanoLucにリジンを1カ所戻したレポーターを用い、ロイシン飢餓によるリボソーム停滞を誘導し、そこに存在するレポーター活性、Ubiquitin化などを解析することで明らかにしていく。
NanoLucはジスルフィド結合を有さず、折りたたみ効率がよい(ACS Chem Biol 2012)。一方で、アミノ酸飢餓による停滞リボソーム上の新生鎖は様々である。申請者は、停滞ribosomeに含まれる分子の結合タンパク質として、TRiCシャペロン構成因子とHSP70を同定しており、TRiCシャペロンにより折りたたまれる新生鎖も数多く存在すると予測される(未発表)。そこで、TRiCの新生鎖運命決定に対する役割について、TRiC構成因子ノックダウンや、ATPase変異体高発現、HSP70阻害剤を用いて解析する。これを実現するため、既知のTRiCシャペロンがターゲットとするβsheet構造を有する配列(VHL遺伝子産物などをNanoLucとスペーサー配列の間に導入したレポーターを作成する。これを用いて、TRiCの新生鎖運命決定に対する役割について解析する。

代表的な論文

1.
  1. Yamashita A, Ohnishi T, Kashima I, Taya Y, Ohno S.
    Human SMG-1, a novel phosphatidylinositol 3-kinase-related protein kinase, associates with components of the mRNA surveillance complex and is involved in the regulation of nonsense-mediated mRNA decay.
    Genes Dev, 1;15(17), 2215-28. (2001)

2.
  1. Ohnishi T, Yamashita A, Kashima I, Schell T, Anders KR, Grimson A, Hachiya T, Hentze MW, Anderson P, Ohno S.
    Phosphorylation of hUPF1 induces formation of mRNA surveillance complexes containing hSMG-5 and hSMG-7.
    Mol Cell, 12(5), 1187-200. (2003)

3.
  1. Usuki F, Yamashita A, Higuchi I, Ohnishi T, Shiraishi T, Osame M, Ohno S.
    Inhibition of nonsense-mediated mRNA decay rescues the phenotype in Ullrich's disease.
    Ann Neurol, 55(5), 740-4. (2004)

4.
  1. Chang TC, Yamashita A, Chen CY, Yamashita Y, Zhu W, Durdan S, Kahvejian A, Sonenberg N, Shyu AB.
    UNR, a new partner of poly(A)-binding protein, plays a key role in translationally coupled mRNA turnover mediated by the c-fos major coding-region determinant.
    Genes Dev, 15;18(16), 2010-23. (2004)

5.
  1. Yamashita A, Chang TC, Yamashita Y, Zhu W, Zhong Z, Chen CY, Shyu AB.
    Concerted action of poly(A) nucleases and decapping enzyme in mammalian mRNA turnover.
    Nat Struct Mol Biol, 12(12), 1054-63. (2005)

6.
  1. Kashima I, Yamashita A, Izumi N, Kataoka N, Morishita R, Hoshino S, Ohno M, Dreyfuss G, Ohno S.
    Binding of a novel SMG-1-Upf1-eRF1-eRF3 complex (SURF) to the exon junction complex triggers Upf1 phosphorylation and nonsense-mediated mRNA decay.
    Genes Dev, 1;20(3), 355-67. (2006)

7.
  1. Usuki F, Yamashita A, Kashima I, Higuchi I, Osame M, Ohno S.
    Specific inhibition of nonsense-mediated mRNA decay components, SMG-1 or Upf1, rescues the phenotype of Ullrich disease fibroblasts.
    Mol Ther, 14(3), 351-60. (2006)

8.
  1. Morita T, Yamashita A, Kashima I, Ogata K, Ishiura S, Ohno S.
    Distant N- and C-terminal domains are required for intrinsic kinase activity of SMG-1, a critical component of nonsense-mediated mRNA decay.
    J Biol Chem, 16;282(11), 7799-808. (2007)

9.
  1. Chen CY, Yamashita Y, Chang TC, Yamashita A, Zhu W, Zhong Z, Shyu AB.
    Versatile applications of transcriptional pulsing to study mRNA turnover in mammalian cells.
    RNA, 13(10), 1775-86. (2007)

10.
  1. Ezzeddine N, Chang TC, Zhu W, Yamashita A, Chen CY, Zhong Z, Yamashita Y, Zheng D, Shyu AB.
    Human TOB, an antiproliferative transcription factor, is a poly(A)-binding protein-dependent positive regulator of cytoplasmic mRNA deadenylation.
    Mol Cell Biol, 27(22), 7791-801. (2007)

11.
  1. Yamashita A, Izumi N, Kashima I, Ohnishi T, Saari B, Katsuhata Y, Muramatsu R, Morita T, Iwamatsu A, Hachiya T, Kurata R, Hirano H, Anderson P, Ohno S.
    SMG-8 and SMG-9, two novel subunits of the SMG-1 complex, regulate remodeling of the mRNA surveillance complex during nonsense-mediated mRNA decay.
    Genes Dev, 1;23(9), 1091-105. (2009)

12.
  1. Yamashita A, Ohno S.
    Analysis of nonsense-mediated mRNA decay by monitoring mRNA half-lives in mammalian cells.
    Cold Spring Harb Protoc, 2010(2)

13.
  1. Izumi N, Yamashita A, Iwamatsu A, Kurata R, Nakamura H, Saari B, Hirano H, Anderson P, Ohno S.
    AAA+ proteins RUVBL1 and RUVBL2 coordinate PIKK activity and  function in nonsense-mediated mRNA decay.
    Sci Signal, 6;3(116), ra27. (2010)

14.
  1. Fernández IS, Yamashita A, Arias-Palomo E, Bamba Y, Bartolomé RA, Canales MA, Teixidó J, Ohno S, Llorca O.
    Characterization of SMG-9, an essential component of the nonsense-mediated mRNA decay SMG1C complex.
    Nucleic Acids Res, 39(1), 347-58. (2011)

15.
  1. Usuki F, Yamashita A, Fujimura M.
    Post-transcriptional defects of antioxidant selenoenzymes cause oxidative stress under methylmercury exposure.
    J Biol Chem, 25;286(8), 6641-9. (2011)

16.
  1. Arias-Palomo E, Yamashita A, Fernández IS, Núñez-Ramírez R, Bamba Y, Izumi N, Ohno S, Llorca O.
    The nonsense-mediated mRNA decay SMG-1 kinase is regulated by large-scale conformational changes controlled by SMG-8.

    Genes Dev, 15;25(2), 153-64. (2011)
17.
  1. Brown JA, Roberts TL, Richards R, Woods R, Birrell G, Lim YC, Ohno S, Yamashita A, Abraham RT, Gueven N, Lavin MF.
    A novel role for hSMG-1 in stress granule formation.

    Mol Cell Biol, 31(22), 4417-29. (2011)
18.
  1. Okada-Katsuhata Y, Yamashita A, Kutsuzawa K, Izumi N, Hirahara F, Ohno S.
    N- and C-terminal Upf1 phosphorylations create binding platforms for SMG-6 and SMG-5:SMG-7 during NMD.

    Nucleic Acids Res, 40(3), 1251-66. (2012)
19.
  1. Abe K, Ishigami T, Shyu AB, Ohno S, Umemura S, Yamashita A.
    Analysis of interferon-beta mRNA stability control after poly(I:C) stimulation using RNA
    metabolic labeling by ethynyluridine.
    Biochem Biophys Res Commun, 9;428(1), 44-9. (2012)

20.
  1. Usuki F, Fujimura M, Yamashita A.
    Endoplasmic reticulum stress preconditioning attenuates methylmercury-induced cellular damage by inducing favorable stress responses.
    Sci Rep, 3, 2346. (2013)

21.
  1. Usuki F, Yamashita A, Shiraishi T, Shiga A, Onodera O, Higuchi I, Ohno S.
    Inhibition of SMG-8, a subunit of SMG-1 kinase, ameliorates nonsense-mediated mRNA decay-exacerbated mutant phenotypes without cytotoxicity.
    Proc Natl Acad Sci USA, 10;110(37), 15037-42. (2013)

22.
  1. Melero R, Uchiyama A, Castaño R, Kataoka N, Kurosawa H, Ohno S, Yamashita A, Llorca O.
    Structures of SMG1-UPFs complexes: SMG1 contributes to regulate UPF2-dependent activation of UPF1 in NMD.
    Structure, 5;22(8), 1105-19. (2014)

23.
  1. Nicholson P, Josi C, Kurosawa H, Yamashita A, Mühlemann O.
    A novel phosphorylation-independent interaction between SMG6 and UPF1 is essential for human NMD.
    Nucleic Acids Res, 42(14), 9217-35. (2014)

24.
  1. López-Perrote A, Castaño R, Melero R, Zamarro T, Kurosawa H, Ohnishi T, Uchiyama A, Aoyagi K, Buchwald G, Kataoka N, Yamashita A, Llorca O.
    Human nonsense-mediated mRNA decay factor UPF2 interacts directly with eRF3 and the SURF complex.
    Nucleic Acids Res, 29;44(4), 1909-23. (2016)

25.
  1. Melero R, Hug N, López-Perrote A, Yamashita A, Cáceres JF, Llorca O.
    The RNA helicase DHX34 functions as a scaffold for SMG1-mediated UPF1 phosphorylation.
    Nat Commun, 4;7, 10585. (2016)

総説

  1. Yamashita A.
    SMG1.
    Biochim Biophys Acta. 30, 1754(1-2), 305-15. (2005)

    Yamashita A, Takeuchi O.
    Translational control of mRNAs by 3'-Untranslated region binding proteins.
    BMB Rep. 50(4), 194-200. (2017)

    Schweingruber C, Rufener SC, Zünd D, Yamashita A, Mühlemann O.
    Nonsense-mediated mRNA decay - mechanisms of substrate mRNA recognition and degradation in mammalian cells.
    Biochim Biophys Acta. 1829(6-7), 612-23. (2013)

    Yamashita A.
    Role of SMG-1-mediated Upf1 phosphorylation in mammalian nonsense-mediated mRNA decay.
    Genes Cells. 18(3), 161-75. (2013)

    Izumi N, Yamashita A, Ohno S.
    Integrated regulation of PIKK-mediated stress responses by AAA+ proteins RUVBL1 and RUVBL2.
    Nucleus. 3(1), 29-43. (2012)

    Yamashita A, Kashima I, Ohno S.
    The role of SMG-1 in nonsense-mediated mRNA decay.
    Biochim Biophys Acta. 1754(1-2), 305-15. (2005)


  2. 大西哲生,山下暁朗,大野茂男.
    mRNAの構造監視システムと新規プロテインキナーゼhSMG-1の関与
    実験医学. 19(18), 2413-2416. (2001)

    山下暁朗, 大西哲生, 大野茂男.
    mRNAサーベイランス
    タンパク質核酸酵素 47(2), 101-112. (2002)

    山下暁朗,鹿島勲,大野茂男.
    hUpf1のリン酸化と脱リン酸化によるmRNA監視複合体リモデリング.
    実験医学. 22(4), 522-525. (2004)

    鹿島勲,山下暁朗,大野茂男.
    mRNA品質管理システムにおけるナンセンスコドン認識の分子機構.
    実験医学. 24(7), 964-967. (2006)

    山下暁朗,臼杵扶佐子.
    mRNA品質管理システムと疾患.
    タンパク質核酸酵素. 54(16), 2219-2225. (2009)

    臼杵扶佐子,山下暁朗
    NMDと疾患.
    細胞工学. 29(2), 155-160. (2010)

    山下暁朗,臼杵扶佐子.
    mRNA surveillanceの分子機構と生命現象、疾患との関わり.
    実験医学. 28(10), 134-141. (2010)

    山下暁朗
    異常なmRNAを分解する仕組み.
    臨床検査. 55(9), 885-891. (2011)

    山下暁朗
    mRNA 品質管理機構の分子基盤と医療応用.
    横浜医学. 63, 31-46. (2012)

    山下暁朗
    mRNA 品質管理機構の最新理解と新たな標的治療の可能性.
    実験医学. 30(9): 1471-1480. (2012)

    山下暁朗,竹内 理.
    mRNA 3'UTR結合タンパク質による翻訳制御.
    細胞工学.34 (8),762-765. (2015)

    山下暁朗
    miRNAによる標的制御.
    実験医学. 33(20), 3244-3255. (2015)

    山下暁朗
    HEK293T細胞を用いたリコンビナントタンパク質精製.
    実験医学.34(18), 3057-3064. (2016)
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研究課題

機動的翻訳速度制御とtRNAレパートリー

研究代表者

吉久 徹(兵庫県立大学・大学院生命理学研究科)
研究室HP

研究概要

近年のribosome profiling等の解析で、意図された翻訳停止/再開、すなわち機動的翻訳制御は新生鎖の機能化に関わる普遍的現象である事が示されつつある。こうした新生鎖の伸長制御は、isodecoder tRNA(anticodonが同じtRNA種)の濃度や量比、即ち“tRNAレパートリー”の影響下にあると考えられる。しかし、真核細胞のtRNAレパートリーが翻訳に及ぼす影響や、機動的に停止した翻訳の解除機構には不明な点が多い。さらに、正常な翻訳停止状態が、No-Go Decay(NGD)品質管理の対象となる異常な翻訳中断とどう区別されるかも判っていない。本研究では、新生鎖の機能化に関わる機動的翻訳制御について、tRNAレパートリーという視点を含む3研究項目について、出芽酵母を用いた研究を進める。
【1】積極的なtRNAレパートリーの改変を通じ、機動的翻訳制御に各isodecoderがどう寄与するかを明らかにする。このため、複数の同義遺伝子にコードされたtRNAの発現をCRISPRi等で抑制できる酵母株群を構築、新開発のtRNA絶対定量法を用いて各株中のtRNAレパートリーの全体像を計測する。そうしたtRNA環境中での翻訳状態をモデルタンパク質による系統的な解析等で調べる。
【2】近年明らかとなったORFの5'側領域でリボソームが停滞するORF群について、こうしたモノソーム状態を形成・解消する機構を明らかにする。まずはこれらから、rare codon非依存にモノソームに集積するORFを選び、mRNAと新生鎖いずれが翻訳停止を引き起こすか、停止誘引配列情報は何かを明らかにする。また、ミトコンドリアタンパク質をコードするORFに着目し、その翻訳停滞解消とミトコンドリアへのRNC局在化の関連について遺伝学的に検討する。
【3】rare codon依存の翻訳一時停止からの復帰には何らかの因子が必要なのか、rare codon依存の新生鎖フォルディングやリボソーム・新生鎖複合体のオルガネラ標的化を伴う翻訳一時停止はNGDと競合するのかを解明する。このため、rare codon反復配列を含むレポーターを構築し、翻訳停止の解除因子を遺伝学的に探索する。同定できた遺伝子の翻訳停止解除を介した新生鎖の機能化への寄与を、in vivoおよびin vitroの翻訳解析で検討する。次に、rare codon依存の機動的翻訳停止とNGDがリボソームのA siteに対するtRNAとNGD因子との競合で決まる可能性について、tRNAレパートリーの改変やNGD因子高発現株等で検討する。
 本計画ではこうした解析を通じ、機動的翻訳停止の真核生物のproteome形成への関与を明らかにする。同時に、生物がtRNAレパートリーをどう利用しているかについても知見を得る。

代表的な論文

1.
  1. Takano, T., Kajita, T., Mochizuki, M., Endo, T., and Yoshihisa, T.
    Cytosolic Hsp70 and co-chaperones constitute a novel system for tRNA import into the nucleus.
    eLife, 4, e04659 (2015)

2.
  1. Mori, S., Kajita, T., Endo, T., and Yoshihisa, T.
    The intron of tRNA-TrpCCA is dispensable for growth and translation of Saccharomyces cerevisiae.
    RNA, 17, 1760-1769 (2011)
3.
  1. Mori, T., Ogasawara, C., Inada, T., Englert, M., Beier, H., and Yoshihisa, T.
    Dual functions of yeast tRNA ligase in the unfolded protein response: unconventional cytoplasmic splicing of HAC1 pre-mRNA is not sufficient to release translational attenuation.
    Mol. Biol. Cell, 21, 3722-3734 (2010)

4.
  1. Takano, A., Endo, T., and Yoshihisa, T.
    tRNA actively shuttles between the nucleus and cytosol in yeast.

    Science, 309, 140-142 (2005)

総説

  1. Yoshihisa, T.
    Nucleocytoplasmic shuttling of tRNAs and implication of the cytosolic Hsp70 in tRNA import,
    Nucleus, 6, 339-343 (2015)

    Yoshihisa, T.
    tRNA Subcellular Dynamics, in "Advances in Molecular Biology and Medicine,
    RNA Regulation Volume 1," ed. by Meyers, pp. 513-543, Wiley-Blackwell, Weinheim, Germany (2014)

    Yoshihisa, T.
    Handling tRNA introns, archaeal way and eukaryotic way.
    Frontiers in Genetics, 5: e00213 (2014)
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研究課題

膜タンパク質の伸長途上鎖をハンドリングする分子機構の解明

研究代表者

阪口 雅郎(兵庫県立大学・大学院生命理学研究科)
研究室HP

研究概要

真核細胞の小胞体にある膜結合リボソームは、分泌タンパク質・膜タンパク質の大半を合成している。このリボソームから伸長してくる新生鎖は、タンパク質膜透過チャネル「トランスロコン」を介して、膜透過し、あるいは膜に組み込まれる。トランスロコンは新生鎖を順次スキャンし、膜透過か、膜組み込みかを選択し、マルチスパン膜タンパク質の構造形成を制御する、いわば新生鎖のハンドリング装置である。我々はトランスロコン機能が、結合しているリボソームによって制御され、さらにその制御様式がリボソームトンネル内にある新生鎖の配列によって変化することを見出してきた。さらに、新生鎖上の正電荷のトランスロコン孔での透過停止の発見や、マルチスパン膜タンパク質の組み込みにおける1型シグナルアンカーによる低疎水性鎖の膜組み込みの実証など、トランスロコンによる新生鎖のハンドリング機構の研究で成果をあげてきた。また、ペルオキシソーム膜タンパク質(PMP70)の小胞体標的化を抑制する配列モチーフ(ETSモチーフ)を発見し、それに作用する因子の精製同定に至っている。本研究では、トランスロコン・リボソームの機能連携を追求すると同時に、トランスロコンによる新生鎖認識の実像を追及し、ペルオキシソーム膜タンパク質の新生鎖ハンドリングの機能に迫る。具体的には下記項目に焦点をあてる。
【1】トランスロコン新奇機能部位の特定とそのリボソームによる機能制御の解明
【2】新奇新生鎖フォールディングプローブ(CP-EGFP)によるトランスロコン制御因子の解明
【3】膜タンパク質新生鎖の小胞体標的化を抑制する因子の機能解明

代表的な論文

1.
  1. Kida, Y. and Sakaguchi, M.
    Interaction mapping of the Sec61 translocon identifies two Sec61α regions interacting with hydrophobic segments in translocating chains.
    J. Biol. Chem. 293, 17050-17060 (2018) doi: 10.1074/jbc.RA118.003219

2.
  1. *Kida, Y., Ishihara, Y., Fujita, H., Onishi, Y. and *Sakaguchi, M.
    Stability and flexibility of marginally hydrophobic segments stalling at the endoplasmic reticulum translocon.
    Mol. Biol. Cell 27, 930-940 (2016)

3.
  1. Sakaue, H., Iwashita, S., Yamashita, Y., Kida, Y., *Sakaguchi, M.
    The N-terminal motif of PMP70 suppresses cotranslational targeting to the endoplasmic reticulum.
    J. Biochem. 159, 539-551 (2016)

4.
  1. Kang, K., Takahara, M., Sakaue, H., *Sakaguchi, M.
    Capsid protease domain as a tool for assessing protein-domain folding during organelle import of nascent polypeptides in living cells
    J. Biochem. 159, 497-508 (2016)

5.
  1. Yamagishi, M., Onishi, Y., Yoshimura, S., Fujita, H., Imai, K., Kida, Y., and *Sakaguchi, M.
    A few positively charged residues slow movement of a polypeptide chain across the endoplasmic reticulum membrane.
    Biochemistry 53, 5375-5383 (2014)

6.
  1. Onishi, Y., Yamagishi, M., Imai, K., Fujita, H., Kida, Y., and *Sakaguchi, M.
    Stop-and-move of a marginally hydrophobic segment translocating across the endoplasmic reticulum membrane.
    J. Mol. Biol. 425, 3205-3216 (2013)

7.
  1. Yabuki, T., Morimoto, F., Kida, Y., and *Sakaguchi, M.
    Membrane translocation of lumenal domains of membrane proteins powered by downstream transmembrane sequences.
    Mol. Biol. Cell 24, 3123-3132 (2013)

8.
  1. Yamamoto, H., Fujita, H., Kida, Y., and *Sakaguchi, M.
    Pleiotropic effects of membrane cholesterol on protein translocation across the ER membrane.
    Biochemistry 51, 3596-3605 (2012)

9.
  1. Yamagishi, M., Fujita, H., Morimoto, F., Kida, Y., and *Sakaguchi, M.
    A sugar chain at a specific position in the nascent polypeptide chain induces forward movement during translocation through the translocon.
    J. Biochem., 149, 591-600 (2011)

10.
  1. Fujita, H., Yamagishi, M., Kida, Y., and *Sakaguchi, M.
    Positive charges on the translocating polypeptide chain arrest movement through the translocon.
    J. Cell Sci. 124, 4184-4193 (2011)

11.
  1. Kida, Y., Kume, C., Hirano, M., and *Sakaguchi, M.
    Environmental transition of signal-anchor sequences during membrane insertion via the endoplasmic reticulum translocon.
    Mol. Biol. Cell 21, 418-429 (2010)

12.
  1. Fujita, H., Kida, Y., Hagiwara, M., Morimoto, F., and *Sakaguchi, M.
    Positive charges of translocating polypeptide chain retrieve an upstream marginal hydrophobic segment from the endoplasmic reticulum lumen to the translocon.
    Mol. Biol. Cell 21, 2045-2056 (2010)

13.
  1. Kida, Y., Morimoto, F., and *Sakaguchi, M.
    Signal-anchor sequence provides motive force for polypeptide chain translocation through the endoplasmic reticulum membrane.
    J. Biol. Chem. 284, 2861-2866 (2009)

14.
  1. Kida, Y., Morimoto, F., and *Sakaguchi, M.
    Two translocating hydrophilic segments of a nascent chain span the ER membrane during multispanning protein topogenesis.
    J. Cell Biol. 179, 1441-1452 (2007)

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研究課題

mRNAディスプレイ法による翻訳アレスト配列の大規模探索

研究代表者

土居 信英(慶應義塾大学・大学院理工学研究科 教授)
研究室HP

研究概要

翻訳アレスト配列は、新生鎖の翻訳伸長速度を調節し、様々な生命現象に関与することが明らかになっているが、これまでに見出された翻訳アレスト配列のモチーフは多様であり、未だ従来法では見つかっていない多くのアレスト配列やその制御配列が存在する可能性も指摘されている。そこで本研究では、これまでに私たちがタンパク質の試験管内進化や相互作用解析に活用してきた「mRNAディスプレイ法」を応用して、様々な生物種における翻訳アレスト配列を試験管内で大規模に探索することを目的としている。
mRNAディスプレイ法では、終止コドンを含まないmRNAの3'末端にポリエチレングリコール(PEG)スペーサーを介してピューロマイシンを付加し、それを鋳型として無細胞翻訳を行うことで、リボソームがmRNAの末端(PEGスペーサーの直前)で停止し、新生鎖のC末端にピューロマイシンが共有結合し、mRNA-タンパク質連結分子が形成される。図に示すように、終止コドンを含むmRNAではmRNA-タンパク質連結分子は形成されないが、終止コドンの前のゲノム断片ライブラリーの中に翻訳アレスト配列が存在する場合、mRNA-タンパク質連結分子が形成される。ライブラリーの上流の精製用タグ配列を利用してmRNA-タンパク質連結分子のタンパク質部分で精製した後、得られたmRNA部分を次世代シークエンサー(NGS)で配列解読し、ゲノムにマッピングすることで、翻訳アレスト配列を大規模に同定することが期待できる。
これまでに大腸菌由来の再構成型無細胞翻訳系PUREシステムを用いて、大腸菌ゲノム断片ライブラリーから多様な翻訳アレスト配列を試験管内選択することができたので(論文投稿準備中)、本研究では、本手法の対象を拡張し、動物や植物などさまざまな生物種由来の無細胞翻訳系を用いて、翻訳アレスト配列の大規模探索をおこなう予定である。

代表的な論文

1.
  1. Sudo K, Niikura K, Iwaki K, Kohyama S, Fujiwara K, *Doi N.
    Human-derived fusogenic peptides for the intracellular delivery of proteins.
    J. Control. Release, 255, 1-11. (2017)

2.
  1. Nagumo Y, Fujiwara K, Horisawa K, Yanagawa H, *Doi N.
    PURE mRNA display for in vitro selection of single-chain antibodies.
    J. Biochem., 159, 519-526. (2016)

3.
  1. Niikura K, Horisawa K, *Doi N.
    A fusogenic peptide from a sea urchin fertilization protein promotes intracellular delivery of biomacromolecules by facilitating endosomal escape.
    J. Control. Release, 212, 85-93. (2015)

4.
  1. Oyobiki R, Kato T, Katayama M, Sugitani A, Watanabe T, Einaga Y, Matsumoto Y, Horisawa K, *Doi N.
    Toward high-throughput screening of NAD(P)-dependent oxidoreductases using boron-doped diamond microelectrodes and microfluidic devices.
    Anal. Chem., 86, 9570-9575. (2014)

5.
  1. Tokunaga M, Shiheido H, Hayakawa I, Utsumi A, Takashima H, *Doi N, Horisawa K, Sakuma-Yonemura Y, Tabata N, Yanagawa H.
    Hereditary spastic paraplegia protein spartin is an FK506-binding protein identified by mRNA Display.
    Chem. Biol., 20, 935-942. (2013)

6.
  1. *Doi N, Yamakawa N, Matsumoto H, Yamamoto Y, Nagano T, Matsumura N, Horisawa K, Yanagawa H.
    DNA display selection of peptide ligands for a full-length human G protein-coupled receptor on CHO-K1 cells.

    PLoS ONE, 7, e30084 (2012)
7.
  1. Shiheido H, Takashima H, *Doi N, Yanagawa H.
    mRNA display selection of an optimized MDM2-binding peptide that potently inhibits MDM2-p53 interaction.
    PLoS ONE, 6, e17898 (2011)

8.
  1. Tanaka J, *Doi N, Takashima H, *Yanagawa H.
    Comparative characterization of random-sequence proteins consisting of 5, 12 and 20 kinds of amino acids.
    Protein Sci., 19, 786-795. (2010)

9.
  1. Sumida T, *Doi N, *Yanagawa H.
    Bicistronic DNA display for in vitro selection of Fab fragments.
    Nucleic Acids Res., 37, e147 (2009)

10.
  1. Horisawa K, Doi N, *Yanagawa H.
    Use of cDNA tiling arrays for identifying protein-interactions selected by in vitro display technologies.
    PLoS ONE, 3, e1646 (2008)

11.
  1. Kawahashi Y, Doi N, Oishi Y, Tsuda C, Takashima H, Baba T, Mori H, Ito T, *Yanagawa H.
    High-throughput fluorescence labeling of full-length cDNA products based on a reconstituted translation system.
    J. Biochem., 141, 19-24. (2007)

12.
  1. Fukuda I, Kojoh K, Tabata N, Doi N, Takashima H, Miyamoto-Sato E, *Yanagawa H.
    In vitro evolution of single-chain antibodies using mRNA display.
    Nucleic Acids Res., 34, e127 (2006)

13.
  1. Doi N, Kakukawa K, Oishi Y, *Yanagawa H.
    High solubility of random-sequence proteins consisting of five kinds of primitive amino acids.
    Protein Eng. Des. Sel., 18, 279-284. (2005)

14.
  1. Doi N, Kumadaki S, Oishi Y, Matsumura N, *Yanagawa H.
    In vitro selection of restriction endonucleases by in vitro compartmentalization.
    Nucleic Acids Res., 32, e95 (2004)

15.
  1. Yonezawa M, Doi N, Kawahashi Y, Higashinakagawa T, *Yanagawa H.
    DNA display for in vitro selection of diverse peptide libraries.
    Nucleic Acids Res., 31, e118 (2003)

16.
  1. Doi N, Takashima H, Kinjo M, Sakata K, Kawahashi Y, Oishi Y, Oyama R, Miyamoto-Sato E, Sawasaki T, Endo Y, *Yanagawa H.
    Novel fluorescence labeling and high-throughput assay technologies for in vitro analysis of protein interactions.
    Genome Res., 12, 487-492. (2002)

総説

  1. 土居信英,柳川弘志
    進化分子工学による新規タンパク質の創出とプロテオミクスへの応用.
    「進化分子工学 ~高速分子進化によるタンパク質・核酸の開発~」(伏見譲編)
    NTS出版,pp. 275-286 (2013)


    土居信英
    無細胞提示系による低分子抗体の試験管内進化.
    「次世代医薬開発に向けた抗体工学の最前線」
    シーエムシー出版,pp. 66-73 (2012)

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研究課題

新生鎖による小胞体還元ネットワーク構築機構の解明

研究代表者

潮田 亮(京都産業大学・総合生命科学部 研究助教)
研究室HP

研究概要

リボソームから合成された新生ポリペプチド鎖(新生鎖)は、システイン残基のチオール基が開裂(還元)状態で小胞体に挿入され、立体構造形成に寄与するジスルフィド結合の形成(酸化)はその機能発現に必須である。タンパク質のジスルフィド結合形成の場として小胞体が優れている点は、レドックス環境がサイトゾルと比較し、酸化的に保たれ、自発的なジスルフィド結合形成が起こりやすいこと、また約20種類の酸化還元酵素によってこれらタンパク質のジスルフィド結合が触媒されることにある。タンパク質のフォールディングに伴うジスルフィド酸化異性化酵素は、基質から電子を受け取ることで基質のジスルフィド結合形成を触媒する。この電子の流れは小胞体でネットワークを形成し、最終的にEro1-PDI複合体が電子を酸素分子に受け渡す(K. Araki et al. J. Cell Biol. 2013)。このようにタンパク質の新生から成熟の過程でタンパク質の酸化が密接に関わる事が明らかにされる一方で、小胞体内腔の還元酵素の存在は不明であった。
我々は、小胞体で初めて還元活性に特化したジスルフィド還元酵素ERdj5を同定し、分解基質のジスルフィド結合を還元し、再び一本のポリペプチド鎖にすることによって小胞体からサイトゾルへの効率よく逆行輸送させていることを示した(R. Ushioda et al.Science 2008、 R. Ushioda et al.Mol. Biol. Cell.2013)。また、ERdj5全長の結晶構造を解き(M. Hagiwara et al.Mol. Cell 2011)、構造解析を基盤としたより詳細な分子メカニズムの解明に貢献してきた。また、最近では小胞体カルシウムポンプのジスルフィド結合を解離することにより、ポンプ活性を促進することがわかり、小胞体カルシウム恒常性にも寄与することを明らかにした(R. Ushioda et al.PNAS.2016)。
しかし、小胞体内腔のレドックス制御機構はいまだ不明な点が多く、特に、小胞体における還元ソースとそのパスウェイは全く同定されていない。グルタチオンやNADP(H)は小胞体内腔のレドックス環境を構成しているが、その還元力を還元酵素に提供している証拠はなく、世界的にも多くの研究者が還元メカニズムの解明に注目している。
本研究では、未だにわかっていないERdj5の還元メカニズムに関して、新生鎖に着目し、小胞体に挿入された新生鎖の還元力が小胞体のレドックス環境に与える影響、およびERdj5への還元力の供給に着目して研究を行っている。


代表的な論文

1.
  1. Maegawa K, Watanabe S, Noi K, Okumura M, Amagai Y, Inoue M, Ushioda R, Nagata K, Ogura T. and Inaba K.
    The highly dynamic nature of ERdj5 is key to efficient elimination of aberrant protein oligomers through ER-associated degradation
    Structure, S0969-2126(17) 30102-8.(2017)
2.
  1. Araki K, Ushioda R, Kusano H, Tanaka R, Hatta T, Fukui K, Nagata K, Natsume T.
    A crosslinker-based identification of redox relay targets
    Anal. Biochem., 1, 520, 22-26. (2017)
3.
  1. R Ushioda, A Miyamotod, M Inoue, S Watanabe, M Okumurae, K Maegawa, K Uegaki, S Fujii, Y Fukuda, M Umitsu, J Takagi, K Inaba, K Mikoshibad, and K Nagata.
    Redox-assisted regulation of Ca2+ homeostasis in the endoplasmic reticulum by disulfide reductase ERdj5
    Proc Natl Acad Sci U S A., 113(41), E6055-E6063. (2016)
4.
  1. Kawasaki K, Ushioda R, Ito S, Ikeda K, Masago Y, Nagata K.
    Deletion of the Collagen-specific Molecular Chaperone Hsp47 Causes Endoplasmic Reticulum Stress-mediated Apoptosis of Hepatic Stellate Cells.
    J Biol Chem., 290, 3639-3646. (2015)
5.
  1. Avezov E, Konno T, Zyryanova A, Chen W, Laine R, Crespillo-Casado A, Melo E, Ushioda R, Nagata K, Kaminski CF, Harding HP, Ron D.
    Retarded PDI diffusion and a reductive shift in poise of the calcium depleted endoplasmic reticulum
    BMC Biol., 10, 13(1), 2 (2015)
6.
  1. R Ushioda, J Hoseki, K Nagata.
    Glycosylation-independent ERAD patway serves as a backup system under ER stress.
    Mol Biol Cell., 24(20), 3155-63. (2013)
7.
  1. M Hagiwara, K Maegawa, M Suzuki, R Ushioda, K Araki, Y Matsumoto, J Hoseki, *K Nagata and K Inaba.
    Structural basis of an ERAD pathway mediated by the ER-resident protein disulfide reductase ERdj5.
    Mol Cell., 41(4), 432-444. (2011)
8.
  1. R Ushioda, J Hoseki, K Araki, G Jansen, D. Y Thomas, & K Nagata.
    ERdj5 is required as a disulfide reductase for degradation of misfolded proteins in the ER.
    Science, 321(5888), 569-72. (2008)

総説

  1. R Ushioda and K Nagata.
    The endoplasmic reticulum-associated degradation and disulfide reductase ERdj5. (review)
    Methods Enzymol., 490, 235-58. (2011)


    J Hoseki, R Ushioda and K Nagata.
    Mechanism and components of endoplasmic reticulum-associated degradation. (review)
    Journal of Biochemistry, 147(1), 19-25. (2010)
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研究課題

ウイルスが引き起こす非標準的な翻訳機構の構造基盤

研究代表者

伊藤 拓宏(理化学研究所・ライフサイエンス技術基盤研究センター・ユニットリーダー)
研究室HP

研究概要

ウイルスが宿主のシステムを効率よく乗っ取るために獲得している「普通でない」翻訳機構について、ヒト由来試験管内翻訳システムの特色を生かして試料を調製し、低温電子顕微鏡(cryo-EM)による単粒子解析を行い、機能発現機構について立体構造を基盤として解明することを目的とする。具体的には(1)ピコルナウイルスのコードする2A2BペプチドのRibosome skippingの機構と(2)C型肝炎ウイルス(HCV)のIRESによるリボソーム·ハイジャックの機構の2つのテーマをターゲットとする。(1)ピコルナウイルスのコードする2AペプチドのC末端領域は「8(G/H)D(V/I)ExNPGP-1」というアミノ酸配列の特徴をもち、新生鎖の働きによりC末端の-1位のプロリンはそのN末端側の1位のグリシンには付加されずに、終結因子eRFに依存することなく翻訳が終結する。その後リボソームはかい離することなく、-1位のプロリンをN末端アミノ酸とした新たな2Bペプチド鎖の伸長が始まる。本研究では、脳心筋炎ウイルス(EMCV)の2AペプチドがC末端の1位のグリシンまで翻訳されて停止した状態のリボソームの立体構造を決定し、なぜ2AペプチジルtRNAGlyはプロリルtRNAProとペプチド転移反応を起こさずに切断反応を起こすのかを明らかにすることを目指す。(2)HCV IRESは宿主の翻訳開始因子群に依存せずに翻訳を効率よく開始することができる。本研究ではHCV IRESとリボソームの複合体の立体構造解析を行い、HCVゲノムがどのように宿主のリボソームをハイジャックするのかを立体構造の視点から明らかにすることを目指す。

代表的な論文

1.
  1. hristian, T., Sakaguchi, R., Perlinska, A.P., Lahoud, G., Ito, T., Taylor, E.A., Yokoyama, S., Sulkowska, J.I. and Hou, Y.-M.
    Methyl transfer by substrate signaling from a knotted protein fold.
    Nat Struct Mol Biol, 23, 941-948. (2016)

2.
  1. Kashiwagi, K., Shigeta, T., Imataka, H., Ito, T.* and Yokoyama, S.*
    Expression, purification, and crystallization of Schizosaccharomyces pombe eIF2B.
    J Struct Funct Genomics, 17, 33-38. (2016)
    (* co-corresponding authors)

3.
  1. Kashiwagi, K., Takahashi, M., Nishimoto, M., Hiyama, T.B., Higo, T., Umehara, T., Sakamoto, K., Ito, T.* and Yokoyama, S.*
    Crystal structure of eukaryotic translation initiation factor 2B.
    Nature, 531, 122-125. (2016)
    (* co-corresponding authors)

4.
  1. Ito, T., Masuda, I., Yoshida, K., Goto-Ito, S., Sekine, S., Suh, S.W., Hou, Y.-M. and Yokoyama, S.
    Structural Basis for methyl-donor-dependent and sequence-specific binding to tRNA substrates by knotted methyltransferase TrmD.
    Proc Natl Acad Sci U S A, 112, E4197-E4205. (2015)

5.
  1. Kuwasako, K., Takahashi, M., Unzai, S., Tsuda, K., Yoshikswa, S., He, F., Kobayashi, N., Guntert, P., Shirouzu, M., Ito, T., Tanaka, A., Yokoyama, S., Hagiwara, M., Kuroyanagi, H. and Muto, Y.
    RBFOX and SUP-12 sandwich a G base to cooperatively regulate tissue-specific splicing.
    Nat Struct Mol Biol, 21, 778-86. (2014)

6.
  1. Kashiwagi, K., Ito, T. and Yokoyama, S.
    Crystal structure of the eukaryotic translation initiation factor 2A from Schizosaccharomyces pombe.
    J Struct Funct Genomics, 15, 125-130. (2014)

7.
  1. Georges, L., Goto-Ito, S., Yoshida, K., Ito, T., Yokoyama, S. and Hou, Y.-M.
    Differentiating analogous tRNA methyltransferases by fragments of the methyl donor.
    RNA, 17, 1236-1246. (2011)

8.
  1. Ito, T. and Yokoyama, S.
    Two enzymes bound to one transfer RNA assume alternative conformations for consecutive reactions.
    Nature, 467, 612-616. (2010)

9.
  1. Ito, T., Kiyasu, N., Matsunaga, R., Takahashi, S. and Yokoyama, S.
    Crystal structure of nondiscriminating glutamyl-tRNA synthetase from Thermotoga maritima.
    Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 813-820. (2010)
10.
  1. Goto-Ito, S., Ito, T., Kuratani, M., Bessho, Y. and Yokoyama, S.
    Tertiary structure checkpoint at anticodon loop modification in tRNA functional maturation.
    Nat Struct Mol Biol, 16, 1109-1115. (2009)
11.
  1. Hiyama, T.B., Ito, T., Imataka, H. and Yokoyama, S.
    Crystal Structure of the alpha subunit of human translation initiation factor 2B.
    J Mol Biol, 392, 937-951. (2009)
12.
  1. Ito, T., Marintchev, A. and Wagner, G.
    Solution structure of human initiation factor eIF2a reveals homology to the elongation factor eEF1B.
    Structure, 12, 1693-1704. (2004)

総説

  1. 1.Goto-Ito, S., Ito, T.* and Yokoyama, S.*
    Trm5 and TrmD: two enzymes from distinct origins catalyze the identical tRNA modification, m1G37.
    Biomolecules, 7, E32. (2017)
    (* co-corresponding authors)

    Kashiwagi, K., Ito, T.* and Yokoyama, S.*
    Crystal structure of eIF2B and insights into eIF2-eIF2B interactions.
    FEBS J, 284, 868-874. (2017)
    (* co-corresponding authors)

    柏木一宏、伊藤拓宏、横山茂之
    翻訳開始因子eIF2Bの立体構造‐CATH/VWM型白質脳症の発症機構解明への手がかりとして
    BRAIN and NERVE-神経研究の進歩,69(1),45-50. (2017)

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研究課題

リン酸化酵素の新生鎖における品質管理機構の解明

研究代表者

喜井 勲(理化学研究所・科学技術ハブ推進本部 ユニットリーダー)

研究概要

リン酸化酵素の新生鎖は、翻訳と同時にフォールディングされ、活性ドメインを形成すると報告されています(Lochhead et al., Cell 2005)。活性ドメインは、同一分子内の新生鎖を基質としてリン酸化します。この分子内自己リン酸化は、リン酸化酵素の構造を最適化し、成熟を促進することで、新生鎖の品質管理機構として機能しています。
私たちは、アルツハイマー病などの神経変性疾患に関与すると報告されているリン酸化酵素DYRK1Aに着目し、研究を進めています。この研究の過程(代表的な論文No. 3, 5, 8)で、私たちは、DYRK1Aのフォールディング途中に一過的に存在する「中間体構造」が触媒する分子内自己リン酸化を特異的に阻害する低分子化合物を発見し、その化合物をFINDY(Folding intermediate-selective inhibitor of DYRK1A)と名付けました(代表的な論文No. 1)。興味深いことに、FINDYは完成型DYRK1Aによる基質リン酸化は阻害しませんでした。これらの結果から、フォールディング中間体は、完成型とは異なる特異な構造を有していると考えられます。
さらにFINDYによって自己リン酸化を阻害されたDYRK1Aフォールディング中間体は、速やかに分解されることを見出しました(代表的な論文No. 1)。この結果は、フォールディング中間体の品質管理機構が存在することを示唆しています。

本研究では、このDYRK1Aフォールディング中間体の品質管理機構の解明を進めます。さらに、本研究の成果を他のリン酸化酵素へも応用し、リン酸化酵素新生鎖を標的とした医薬品開発技術の確立を目指します。

代表的な論文

1. *Kii I, Sumida Y, Goto T, Sonamoto R, Okuno Y, Yoshida S, Kato-Sumida T, Koike Y, Abe M, Nonaka Y, Ikura T, Ito N, Shibuya H, Hosoya T, *Hagiwara M.
Selective inhibition of the kinase DYRK1A by targeting its folding process.
Nat Commun, 7, 11391 (2016) *Co-corresponding author
2. *Kii I, Nishiyama T, *Kudo A.
Periostin promotes secretion of fibronectin from the endoplasmic reticulum.
Biochem Biophys Res Commun, 470(4), 888-93 (2016) *Co-corresponding author
3. Sonamoto R, *Kii I, Koike Y, Sumida Y, Kato-Sumida T, Okuno Y, Hosoya T, *Hagiwara M.
Identification of a DYRK1A Inhibitor that Induces Degradation of the Target Kinase using Co-chaperone CDC37 fused with Luciferase nanoKAZ.
Sci Rep, 5, 12728. (2015) *Co-corresponding author
4.
  1. Ohnishi T, Yanazawa M, Sasahara T, Kitamura Y, Hiroaki H, Fukazawa Y, Kii I, Nishiyama T, Kakita A, Takeda H, Takeuchi A, Arai Y, Ito A, Komura H, Hirao H, Satomura K, Inoue M, Muramatsu S, Matsui K, Tada M, Sato M, Saijo E, Shigemitsu Y, Sakai S, Umetsu Y, Goda N, Takino N, Takahashi H, Hagiwara M, Sawasaki T, Iwasaki G, Nakamura Y, Nabeshima Y, Teplow DB, Hoshi M.
    Na, K-ATPase α3 is a death target of Alzheimer patient amyloid-β assembly.

    Proc Natl Acad Sci U S A, 112(32), E4465-74 (2015)
5.
  1. #Masaki S, #Kii I, Sumida Y, Kato-Sumida T, Ogawa Y, Ito N, Nakamura M, Sonamoto R, Kataoka N, Hosoya T, Hagiwara M.
    Design and synthesis of a potent inhibitor of class 1 DYRK kinases as a suppressor of adipogenesis.
    Bioorg Med Chem, 23(15), 4434-41 (2015) #Equally contributed
6.
  1. Morooka S, Hoshina M, Kii I, Okabe T, Kojima H, Inoue N, Okuno Y, Denawa M, Yoshida S, Fukuhara J, Ninomiya K, Ikura T, Furuya T, Nagano T, Noda K, Ishida S, Hosoya T, Ito N, Yoshimura N, Hagiwara M.
    Identification of a Dual Inhibitor of SRPK1 and CK2 That Attenuates Pathological Angiogenesis of Macular Degeneration in Mice.
    Mol Pharmacol, 88(2), 316-25 (2015)

7.
  1. Yamamoto M, Onogi H, Kii I, Yoshida S, Iida K, Sakai H, Abe M, Tsubota T, Ito N, Hosoya T, Hagiwara M.
    CDK9 inhibitor FIT-039 prevents replication of multiple DNA viruses.

    J Clin Invest, 124(8), 3479-88 (2014)
8.
  1. Ogawa Y, Nonaka Y, Goto T, Ohnishi E, Hiramatsu T, Kii I, Yoshida M, Ikura T, Onogi H, Shibuya H, Hosoya T, Ito N, Hagiwara M.
    Development of a novel selective inhibitor of the Down syndrome-related kinase Dyrk1A.
    Nat Commun, 1, 86 (2010)

9.
  1. *Kii I, Shiraishi A, Hiramatsu T, Matsushita T, Uekusa H, Yoshida S, Yamamoto M, Kudo A, Hagiwara M, *Hosoya T.
    Strain-promoted double-click reaction for chemical modification of azido-biomolecules.
    Org Biomol Chem, 8(18), 4051-5 (2010) *Co-corresponding author

10.
  1. Maruhashi T, Kii I, Saito M, Kudo A. Interaction between periostin and BMP-1 promotes proteolytic activation of lysyl oxidase.
    J Biol Chem, 285(17), 13294-303 (2010)

11.
  1. Kii I, Nishiyama T, Li M, Matsumoto K, Saito M, Amizuka N, Kudo A. Incorporation of tenascin-C into the extracellular matrix by periostin underlies an extracellular meshwork architecture.
    J Biol Chem, 285(3), 2028-39 (2010)

12.
  1. Shimazaki M, Nakamura K, Kii I, Kashima T, Amizuka N, Li M, Saito M, Fukuda K, Nishiyama T, Kitajima S, Saga Y, Fukayama M, Sata M, Kudo A. Periostin is essential for cardiac healing after acute myocardial infarction.
    J Exp Med, 205(2), 295-303 (2008)

総説

  1. 喜井 勲、萩原 正敏
    「リン酸化酵素に対する選択的阻害剤の開発」生物活性分子のケミカルバイオロジー
    CSJカレントレビュー Vol. 19 (2015)


    喜井 勲、萩原 正敏
    「キナーゼの多彩な立体構造を標的とした創薬」
    研究成果を薬につなげる アカデミア創薬の戦略と実例
    実験医学増刊 Vol. 32, No. 2 (2014)


    喜井 勲、吉田 優、細谷 孝充
    ダブルクリック反応:生体分子の新しい化学修飾法

    生化学 84 (4), 306–311 (2012)
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研究課題

Chasing translation along the time by novel ribosome profiling

研究代表者

岩崎 信太郎(理化学研究所 開拓研究本部 RNAシステム生化学研究室 主任研究員)
研究室HP

研究概要

一般的な翻訳研究の手法では細胞中に存在するmRNA個別の振る舞いを解析することは難しく、全体の平均を解析しているに過ぎない。しかしながら、近年の研究により、mRNAは個別に翻訳の活性化あるいは不活化されるといった現状が報告されており、平均化されたmRNAの情報だけでは明らかにされない生命現象が明らかになりつつある。本研究では特に「mRNAはその一生の中で常に同じように翻訳をうけるのであろうか?」という問いに挑戦する。これは新生ペプチド鎖合成に関わる根本的なものであるのに関わらず、これまで見過ごされてきた。その原因は新生mRNAからの翻訳を特異的にかつ網羅的に解析する手法がなかったことによる。

ribosome profilingは次世代シーケンサーを利用し、細胞内における翻訳の状態を網羅的に計測することができる画期的手法である。本研究でこれを発展させ、時系列的に新生RNAからの翻訳を定量的にかつ網羅的に解析することができる新規ribosome profiling法を確立することを目指す。このためには新生mRNAを細胞中に既に存在するmRNAと区別することが必要となる。一定時間、塩基誘導体を細胞に導入し転写によって新生mRNAに取り込ませ、その後塩基誘導体を標的に新生mRNA精製する手法が知られている(pulse-chase)。この手法を応用し、新生mRNAが時間と沿って受ける翻訳とその制御をribosome profilingによって明らかにする。この手法(pulse-chase ribosome profilingと呼ぶ)によりこれまでの研究手法では明らかにすることができなかった、mRNAがその一生の中で受ける翻訳制御のダイナミクスを明らかしようと考えている。特に近年RNAの修飾や酸化が翻訳反応に直接影響を与える例が知られており、時間経過と共におこることが予想されることから、これらの点に注目して解析を行うことを計画している。  

代表的な論文

1.
  1. Iwasaki S, Iwasaki W, Takahashi M, Sakamoto A, Watanabe C, Shichino Y, Stephen N. Floor, Fujiwara K, Mito M, Dodo K, Sodeoka M, Imataka H, Honma T, Fukuzawa K, Ito T, Nicholas T. Ingolia.
    The Translation Inhibitor Rocaglamide Targets a Bimolecular Cavity between eIF4A and Polypurine RNA.
    Molecular Cell (2018) in press.
2.
  1. Akichika S, Hirano S, Shichino Y, Suzuki T, Nishimasu H, Ishitani R, Sugita A, Hirose Y, Iwasaki S, Nureki O, Suzuki T.
    Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase.
    Science (2018) in press. DOI: 10.1126/science.aav0080
3.
  1. Taiwa K, Yokoi S, Mito M, Fujii K, Kimura Y, Iwasaki S, Nakagawa S.
    UPA-Seq:Prediction of Functional LncRNAs Using Differential Sensitivity to UV Crosslinking.
    RNA. 2018 in press
4.
  1. Kurihara Y, Makita Y, Kawashima M, Fujita T, Iwasaki S, Matsui M.
    Transcripts from downstream alternative transcription start sites evade uORF-mediated inhibition of gene expression in Arabidopsis.
    Proc Natl Acad Sci U S A. (2018) in press. doi: 10.1073/pnas.1804971115.
5.
  1. Naruse K, Matsuura-Suzuki E, Watanabe M, Iwasaki S, Tomari Y.
    In vitro reconstitution of chaperone-mediated human RISC assembly.
    RNA. 24, 6-11, (2018). doi: 10.1261/rna.063891.117.
6.
  1. Iwasaki S, Tomari Y.
    Reconstitution of RNA Interference Machinery.
    Methods Mol Biol. 1680, 131-143, (2018). doi: 10.1007/978-1-4939-7339-2_9.
7.
  1. Mito M, Kadota M, Tanaka K, Furuta Y, Abe K, Iwasaki S, Nakagawa S.
    Cell Type-Specific Survey of Epigenetic Modifications by Tandem Chromatin Immunoprecipitation Sequencing.
    Sci Rep. 8, 1143 (2018). doi: 10.1038/s41598-018-19494-9.

press release
http://www.riken.jp/pr/press/2018/20180130_2/

8.
  1. Matsuo, Y., Ikeuchi, K., Saeki, Y., Iwasaki S., Schmidt, C., Udagawa, T., Sato, F., Tsuchiya, H., Becker, T., Tanaka, K., Ingolia, NT., Beckmann, R. and *Inada, T.
    Ubiquitination of Stalled Ribosome Triggers Ribosome-associated Quality Control.
    Nat. Commun. DOI 10.1038/s41467-017-00188-1 (2017)

9.
  1. Iwasaki S, Ingolia NT.
    The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies.
    Trends Biochem Sci. 8, 612-624 (2017). doi: 10.1016/j.tibs.2017.05.004. (2017)

10.
  1. Ishikawa K, Makanae K, Iwasaki S, Ingolia NT, Moriya H.
    Post-Translational Dosage Compensation Buffers Genetic Perturbations to Stoichiometry of Protein Complexes.
    PLoS Genet. 25, 13(1), e1006554. (2017)

11.
  1. Iwasaki S, Floor SN, Ingolia NT.
    Rocaglates convert DEAD-box protein eIF4A into a sequence-selective translational repressor.

    Nature, 23, 534(7608), 558-61. (2016)
12.
  1. Werner A, Iwasaki S, McGourty CA, Medina-Ruiz S, Teerikorpi N, Fedrigo I, Ingolia NT, Rape M.
    Cell-fate determination by ubiquitin-dependent regulation of translation.
    Nature, 24, 525(7570), 523-7. (2015)

13.
  1. Iwasaki S*, Sasaki HM*, Sakaguchi Y, Suzuki T, Tadakuma H, Tomari Y.
    Defining fundamental steps in the assembly of the Drosophila RNAi enzyme complex.
    Nature, 28, 521(7553), 533-6. (2015) (* contributed equally)

14.
  1. Iwasaki S*, Kobayashi M*, Yoda M, Sakaguchi Y, Katsuma S, Suzuki T, Tomari Y.
    Hsc70/Hsp90 chaperone machinery mediates ATP-dependent RISC loading of small RNA duplexes.
    Mol Cell, 30, 39(2), 292-9. (2010) (* contributed equally)

15.
  1. Yoda M, Kawamata T, Paroo Z, Ye X, Iwasaki S, Liu Q, Tomari Y.
    ATP-dependent human RISC assembly pathways.
    Nat Struct Mol Biol, 17(1), 17-23. (2010)

16.
  1. Iwasaki S, Kawamata T, Tomari Y.
    Drosophila Argonaute1 and Argonaute2 employ distinct mechanisms for translational repression.
    Mol Cell, 10, 34(1), 58-67. (2009)

17.
  1. Takeda A, Iwasaki S, Watanabe T, Utsumi M, Watanabe Y.
    The mechanism selecting the guide strand from small RNA duplexes is different among Argonaute proteins.

    Plant Cell Physiol, 49(4), 493-500. (2008)
18.
  1. Iwasaki S, Takeda A, Motose H, Watanabe Y.
    Characterization of Arabidopsis decapping proteins AtDCP1 and AtDCP2, which are essential for post-embryonic development.
    FEBS Lett, 29, 581(13), 2455-9. (2007)

総説

  1. 七野悠一、岩崎信太郎
    リボソームプロファイリングが切り拓く翻訳研究の未来
    実験医学 Vol. 25, No. 11, (7月号) 2017 p1868-1873

     

    岩崎信太郎
    ncRNA判定法(リボソームプロファイリング) ノンコーディングRNA  RNA分子の全体像を俯瞰する
    化学同人 (2016)

     

    Iwasaki S, Ingolia NT.
    PROTEIN TRANSLATION. Seeing translation.
    Science. 17, 352(6292), 1391-2. (2016)

     

    Kwak PB*, Iwasaki S*, Tomari Y.
    The microRNA pathway and cancer.
    Cancer Sci. 101(11), 2309-15. (2010) (* contributed equally)

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研究課題

翻訳鋳型核酸の部位特異的大規模解析によるセントラルドグマが持つ高次性の解明

研究代表者

清水 義宏(理化学研究所 生命システム研究センター(QBiC) 無細胞タンパク質合成研究ユニット ユニットリーダー)
研究室HP

研究概要

細胞内外の多様な生命活動を支えるために、タンパク質は20種類もしくはそれ以上のアミノ酸で構成されるポリペプチド鎖からなる膨大な一次配列空間から適切な配列を選択し、多様な生体システムを形成している。こうした多様性を支えるためには、リボソームを中心としたタンパク質合成システムが多様な配列に対応できるような汎用性を備えていると考えられてきた。しかしながら、近年になって、こうしたタンパク質合成装置の高い汎用性に数多くの例外が存在すること、さらに、その例外が様々な生命活動において役割を担っていることが明らかにされてきている。膜分泌モニタータンパク質SecMに見られるリボソーム上でのタンパク質合成の停滞を積極的に引き起こすアミノ酸配列の発見や、連続したプロリン残基を含むようなリボソームが不得手とするアミノ酸の重合が存在し、また、それに対して補助的なタンパク質因子、EF-P/eIF5Aが必要であること、アミノ酸配列が不変であるにもかかわらず同義語コドンへの置換がタンパク質立体構造を変化させてしまう現象 などが観察されている。こうした例外現象はEF-P/eIF5Aに代表されるように例外として処理される機構が備わっている場合もあるが、SecM配列によるタンパク質合成の停滞がSecAの発現量上昇に役割を果たしているように、生体システムに積極的に組み込まれているものも存在しており、核酸が持つ遺伝暗号がタンパク質のアミノ酸配列を規定しているという単純明快に見えたセントラルドグマで記述されるプロセスが、より複雑な階層構造を持ったシステムであることが示唆されている。概日時計タンパク質をコードする核酸配列を、アミノ酸配列は変えずにコドン使用頻度のみを変更することによって概日時計システムの頑強さが失われるといった報告もあり、こうした階層構造への深い理解が生物の多様な生命現象の理解に不可欠であることが分かってきた。

近年、シーケンス技術の急速な進展によってWeissmanらによって開発されたリボソームプロファイリング法などに代表されるように、膨大な配列空間とタンパク質合成を深く関連付ける包括的なアプローチが可能になりつつある。そこで本研究では、次世代シーケンサおよび再構成型無細胞タンパク質合成システムであるPURE systemを利用して、リボソームがmRNAの多様性に対して保持する一般性または特異性を包括的に解析し、セントラルドグマで記述されるプロセスにおける複雑な階層構造を定量的に記述することを目指す。

代表的な論文

1.
  1. *Matsuura, T., Tanimura, N., Hosoda, K., Yomo, T., *Shimizu, Y.

Reaction dynamics analysis of a reconstituted Escherichia coli protein translation system by computational modeling.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 114, E1336-E1344. (2017)

2.
  1. #Narumi, R., #*Shimizu, Y., Ukai-Tadenuma, M., Ode, K. L., Kanda, G. N., Shinohara, Y., Sato, A., Matsumoto, K., *Ueda, H. R. [#equally contributed]

Mass spectrometry-based absolute quantification reveals rhythmic variation of mouse circadian clock proteins.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 113, E3461-E3467. (2016)

3.
  1. #*Tanaka, Y., #*Shimizu, Y. [#equally contributed]

Integration of a reconstituted cell-free protein-synthesis system on a glass microchip.

Anal. Sci., 31, 67-71. (2015)
4.
  1. *Shimizu, Y.

ArfA recruits RF2 into stalled ribosomes.
J. Mol. Biol., 423, 624-631. (2012)

5.
  1. Osada, E., *Shimizu, Y., Akbar, B. K., Kanamori, T., Ueda, T.

Epitope mapping using ribosome display in a reconstituted cell-free protein synthesis system.
J. Biochem., 145, 593-700. (2009)

6.
  1. Qi, H., *Shimizu, Y., Ueda, T.

Ribosomal protein S1 is not essential for the trans-translation machinery.
J. Mol. Biol., 368, 845-852. (2007)

7.
  1. Ohashi, H., *Shimizu, Y., Ying, B. W., Ueda, T.

Efficient protein selection based on ribosome display system with purified components.

Biochem. Biophys. Res. Commun., 352, 270-276. (2007)
8.
  1. #Suto, K., #Shimizu, Y., Watanabe, K., Ueda, T., Fukai, S., Nureki, O. *Tomita, K. [#equally contributed]

Crystal structures of leucyl/phenylalanyl-tRNA-protein transferase and its complex with an aminoacyl-tRNA analog.
EMBO J., 25, 5942-5950. (2006)

9.
  1. Shimizu, Y., *Ueda, T.

SmpB triggers GTP hydrolysis of elongation factor Tu on ribosomes by compensating for the lack of codon-anticodon interaction during trans-translation initiation.
J. Biol. Chem., 281, 15987-15996. (2006)

10.
  1. Shimizu, Y., Kanamori, T., *Ueda, T.

Protein synthesis by pure translation systems.
Methods, 36, 299-304. (2005)

11.
  1. Shimizu, Y., *Ueda, T.

The role of SmpB protein in trans-translation.

FEBS Lett., 514, 74-77. (2002)
12.
  1. Shimizu, Y., Inoue, A., Tomari, Y., Suzuki, T., Yokogawa, T., Nishikawa, K., *Ueda, T.

Cell-free translation reconstituted with purified components.
Nat. Biotechnol., 19, 751-755. (2001)

総説

  1. 安達仁朗, 清水義宏.

第一章 2節 人工細胞と無細胞タンパク質合成システム.
人工細胞の創製とその応用 (シーエムシー出版植田充美監修) 8-14. (2017)


  1. 清水義宏, 木賀大介

無細胞タンパク質合成システム.
生物工学 93: 603-606. (2015)


  1. *Shimizu, Y.

Biochemical aspects of bacterial strategies for handling the incomplete translation processes.
Front. Microbiol., 5, 170. (2014)


  1. Shimizu, Y., Kuruma, Y., Kanamori, T., *Ueda, T.

The PURE System for Protein Production.
Methods Mol. Biol., 1118, 275-284. (2014)


  1. 清水義宏

生命動態システム科学 III. 合成生物学 1. 人工細胞 (4) 生命の部分再構成としてのPURE system.
生体の科学65(5): 498-499. (2014)


  1. 清水義宏

第一章2節 無細胞タンパク質合成.
タンパク質結晶の最前線 (シーエムシー出版杉山成監修) 18-24. (2014)


  1. 清水義宏, 上田卓也

4章 タンパク質合成システムの再構成.
生命システム工学 (化学同人田口精一編) 45-70. (2012)


  1. 清水義宏

自己複製可能な無細胞翻訳系の構築に向けて.
実験医学 29: 1078-1083. (2011)


  1. Shimizu, Y., *Ueda, T.

PURE technology.
Methods Mol. Biol., 607, 11-21. (2010)


  1. Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., *Ueda, T.

Cell-free translation systems for protein engineering.

FEBS J., 273, 4133-4140. (2006)
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研究課題

不良新生鎖に提示される分解シグナルの解明

研究代表者

佐伯 泰(公益財団法人東京都医学総合研究所 蛋白質代謝研究室 副参事研究員)
研究室HP

研究概要

細胞内では、毎分150万個ものタンパク質が新規合成されているが、そのうち12-15%は翻訳に失敗しユビキチン・プロテアソーム系により分解除去される。この翻訳と協調したタンパク質品質管理に中心的な役割を果たしているのがリボソーム品質管理(RQC:ribosome quality control)経路である。RQC経路にはユビキチンリガーゼLtn1やユビキチン選択的シャペロンCdc48が含まれており、不良新生鎖の認識とユビキチン化、停滞リボソームからの不良新生鎖の除去を実行している。不良新生鎖は正しく分解されないと、C末端に付加されるCATテイル(アラニン・スレオニン残基のリピート)により凝集や封入体を形成しシャペロンネットワークの撹乱を引き起こす。つまり、不良新生鎖のクリアラスはタンパク質恒常性の維持に極めて重要であることがわかってきた。
それでは、不良新生鎖の迅速かつ効率的な分解はどのような機構により保障されているのだろうか?本研究では、細胞内で不良新生鎖に提示されるユビキチンシグナルを定量プロテオミクス法により解析し、さらに試験管内再構築を行うことで、Cdc48やRad23によるユビキチン認識、Cdc48のアンフォールダーゼ活性など、効率的なプロテアソーム分解のための必須要素を抽出し、不良新生鎖の分解機構を明らかにします。

代表的な論文

1.

Tsuchiya, H., Burana, D., Ohtake, F., Arai, N., Kaiho, A., Komada, M., Tanaka, K., and Saeki, Y.
Ub-ProT reveals global length and composition of protein ubiquitylation in cells.
Nature Commun. 9, 524 (2018) doi: 10.1038/s41467-018-02869-x

2.
  1. Tsuchiya, H., Ohtake, F., Arai, N., Kaiho, A., Yasuda, S., Tanaka, K., Saeki, Y.

In Vivo Ubiquitin Linkage-type Analysis Reveals that the Cdc48-Rad23/Dsk2 Axis Contributes to K48-linked Chain Specificity of the Proteasome.
Mol Cell, in press.

3.
  1. Ohtake, F., Saeki, Y., Ishido, S., Kanno, J., Tanaka, K.

The K48-K63 branched ubiquitin chain regulates NF-kB signaling.

Mol Cell, 64, 251-266 (2016)
4.
  1. Yoshida, Y., Saeki, Y., Murakami, A., Kawawaki, J., Tsuchiya, H., Yoshihara, H., Shindo, M., Tanaka, K.

A comprehensive method for detecting ubiquitinated substrates using TR-TUBE.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112, 4630-4635 (2015)

5.
  1. Pack, CG., Yukii, H., Toh-e, A., Kudo, T., Tsuchiya, H., Kaiho, A., Sakata, E., Murata, S., Sako, Y., Baumeister, W., Tanaka, K., and Saeki, Y.

Quantitative live-cell imaging reveals spatio-temporal dynamics and cytoplasmic assembly of the 26S proteasome.
Nature Commun, 5, 3396 (2014)

6. Saeki, Y., Toh-e, A., Kudo, T., Kawamura, H., Tanaka, K.

Multiple proteasome-interacting proteins assist the assembly of the yeast 19S regulatory particle.
Cell, 137, 900-913 (2009)

総説

  1. Saeki, Y.

Ubiquitin recognition by the proteasome.
J. Biochem. 161, 113-124 (2017)


  • 佐伯 泰

プロテアソームの作動機構と細胞内動態
生化学87巻, 705-722 (2015)


  • Tanaka, K., Mizushima, N., Saeki, Y.

The proteasome: molecular machinery and pathophysiological roles.

Biol. Chem.393, 217-234 (2012)
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